Анотація до роботи:

Болтовець П.М. Взаємодія антиген-антитіло в умовах поверхневого плазмонного резонансу та застосування цього явища для визначення вірусів. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.06 – вірусологія. - Інститут мікробіології та вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України, Інститут фізики напівпровідників ім. В.Є. Лашкарьова НАН України, Київ, 2004.

Дисертацію присвячено розробці підходу до визначення вірусів безпосередньо в клітинних гомогенатах за допомогою специфічних антитіл методом поверхневого плазмонного резонансу. Запропоновано нову модифікацію поверхні сенсора для визначення вірусів шляхом формування на його поверхні мономолекулярного шару з ефективним негативним зарядом, що запобігає денатурації білків і забезпечує їх орієнтовану іммобілізацію.

Розроблено і випробувано на прикладі вірусу тютюнової мозаїки загальний підхід до виявлення і кількісного визначення вірусів методом ППР за допомогою специфічних антитіл, іммобілізованих на модифікованій KNCS і білком А St. aureus поверхні сенсора. На прикладі культури зеленої водорості Bracteаcoccus minor, інфікованої ВТМ на стадії зооспор, показано, що така модифікація поверхні сенсора дозволяє адекватно визначати вірус в клітинних гомогенатах, що підтверджено методами ІФА і світлової мікроскопії. На моделі структурного білка Х-вірусу картоплі і гексону аденовірусу типу 2 показано можливість використання такого підходу для визначення вірусних білків. Запропоновано нову оригінальну процедуру кількісного визначення вірусу шляхом іммобілізації комплексу специфічні IgG-вірус на модифіковану тіоціанатом і білком А поверхню сенсора. На прикладі Nicotiana tabacum, за допомогою вказаного підходу було досліджено розвиток вірусної інфекції у рослинах. Було отримане узгодження між даними ППР і ІФА.

1. Розроблено спосіб експресної детекції вірусів і вірусних білків з використанням поверхневого плазмонного резонансу шляхом послідовної модифікації поверхні сенсора тіоціанатом, білком А Staphylococcus aureus та іммобілізації специфічних імуноглобулінів G. На моделі вірусу тютюнової мозаїки показано, що використання такого імунного біосенсора дозволяє виявляти та кількісно визначати вірус, зокрема, в інфікованих клітинах. На моделі структурного білка Х-вірусу картоплі і гексону аденовірусу типу 2 показано можливість використання такого підходу для визначення вірусних білків.

2. Розроблено підхід до визначення вірусу шляхом іммобілізації на модифікованій поверхні сенсора комплексу специфічні IgG-вірус, що дозволяє проводити експресну оцінку вмісту вірусу в пробі, як це продемонстровано на моделі вірусу тютюнової мозаїки.

3. Для оптимізації умов орієнтованої іммобілізації антивірусних імуноглобулінів G і подальшої детекції вірусу запропоновано новий спосіб модифікації сенсорного елемента, який полягає у наданні поверхні додаткового заряду шляхом обробки тіоціанатом. На моделі соєвий інгібітор трипсину - трипсин показано можливість управління поведінкою молекули білка на зарядженій поверхні сенсора шляхом зміни її власного зарядового стану.

4. Показано, що при іммобілізації імуноглобулінів G на поверхні золота і їх подальшій взаємодії з антивидовими імуноглобулінами G послідовна модифікація поверхні золотої плівки тіоціанатом і білком А Staphylococcus. aureus створює умови, необхідні для орієнтованої іммобілізації імуноглобулінів G, що мають високу спорідненість до білка А, а отже і подальшої ефективної детекції вірусу за допомогою іммобілізованих таким чином специфічних антитіл.

5. Показано, що білок А St. aureus, іммобілізований на немодифікованій поверхні золота, утворює структури різної конформації, що ускладнює його взаємодію з імуноглобулінами G. В той же час, білок А St. aureus, іммобілізований на поверхні золота, модифікованій тіоціанатом, повністю зберігає здатність до взаємодії з імуноглобулінами G. Тобто, отримана сенсорна поверхня для орієнтованої іммобілізації антивірусних імуноглобулінів G.

Публікації автора:

1. Болтовець П.М., Снопок Б.А., Дяченко Н.С., Ширшов Ю.М., Лампека Я.Д. Орієнтована іммобілізація білка А Staphylococcus aureus на чисту і модифіковану NCS^- поверхню золота: вивчення методом поверхневого плазмонного резонансу // Бюлетень Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН. – 2000. - №7. – с.21-22. (Здобувач самостійно підібрала умови для оптимальної імобілізації білка А Staphylococcus aureus на поверхні сенсора).

2. Болтовец П.Н., Снопок Б.А., Ширшов Ю.М., Дяченко Н.С. Организованные белковые слои для оптоэлектронных биосенсорных систем: ориентированная иммобилизация протеинов на модифицированной поверхности золота // Доповіді Національної Академії Наук України. – 2001. – № 11. – С.137-144. (Здобувачем самостійно проведено експеримент. Отримані дані інтерпретовано із залученням аналізу тривимірної структури молекули STI).

3. Болтовец П.Н., Снопок Б.А., Ширшов Ю.М., Дяченко Н.С. Способ ориентированной иммобилизации белков на модифицированных роданидом золотых поверхностях // Український біохімічний журнал. – 2002. – Т.74, №2. – С.51-55. (Здобувачем особисто проведено модифікацію поверхні сенсора з подальшою імобілізацією білків).

4. Болтовец П.Н., Веревка С.В., Дяченко Н.С., Снопок Б.А., Ширшов Ю.М. Ориентация протеинов на поверхности сенсора и оптимизация процесса иммобилизации путем предварительной защиты активного центра // Український біохімічний журнал. – 2002. – Т.74, №4. – С.71-75. (Здобувачем проведено імобілізацію комплекса STI-T на модифіковану поверхню сенсора).

5. Болтовець П.М., Бойко В.Р., Дяченко Н.С., Снопок Б.А., Ширшов Ю.М. Застосування метода поверхневого плазмонного резонансу для виявлення вірусних антигенів // Вісник Київського Національного Університету. – 2001. – вип.35. – С.9-11. (Здобувачем досліджено можливість виявлення антигену вірусу тютюнової мозаїки в клітинних гомогенатах методом ППР).

6. Boltovets P. M., Boyko V. R., Kostikov I. Yu., Dyachenko N. S., Snopok B. A., Shirshov Yu. M. Simple method for plant virus detection: Effect of antibody immobilization technique // Journal of virological methods. – 2002. – Vol.105, №1. – P.141-146. (Здобувачем проведено виявлення вірусу тютюнової мозаїки у клітинних гомогенатах методом ППР).

7. Болтовець П.М., Бойко В.Р., Іве М., Снопок Б.А., Ширшов Ю.М., Дяченко Н.С. Дослідження взаємодії між імуноглобулінами та виявлення вірусних антигенів у клітинних гомогенатах методом поверхневого плазмонного резонансу // Мікробіологічний журнал. – 2003. – Т.65, №4. – С.51-61. (Здобувачем досліджено іммобілізацію імуноглобулінів на модифіковану поверхню та порівняно виявлення вірусу в гомогенатах клітин методами ППР і ІФА).

8. Болтовец П.Н., Снопок Б.А., Дяченко Н.С., Ширшов Ю.М. Функциональные оптоэлектронные преобразователи для медицины и биологии // Седьмая Международная научно-техническая конференция “Актуальные проблемы твердотельной электроники и микроэлектроники”: труды 7-й международной научно-технической конференции. - Таганрог (Россия), 2000. - С.169-171.

9. Boltovets P.M., Dyachenko N.S., Snopok B.A., Shirshov Yu.M., Lampeka Ya.D. Protein-orientating structures: thyocyanate layers as support for immobilization of bioreceptors // Proc. of SPIE. International conference on optoelectronics technologies. - 2001.- Vol.4425. - P.189-193.

10. Boltovets P.M., Dyachenko N.S., Snopok B.A., Shirshov Yu.M. Nondestructive rapid quantitive method for immunopathology diagnostics: protein orientation at the sensor surface controlled by pH level // Abstracts of the 14th IFCC-FESCC European Congress of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. - Prague (Czech Republic), 2001. - P. 140.

11. Boltovets P.M., Dyachenko N.S., Snopok B.A., Shirshov Yu.M. Driving forces of biomolecular organisation specific to nanometer scale: protein orientation on the surface, controlled by pH level // European Journal of Biochemistry. – 2001. – Vol. 268, suppl1. – P.44.

12. Boltovets P.M., Boyko V.R., Snopok B.A., Shirshov Yu.M. Application of surface plasmon resonance for virus antigen detection in alga cells // 3rd International Conference “Bioresurses and Viruses”. - Kyiv (Ukraine), 2001. – P.5, 109.

13. Boltovets P.M., Veryovka S.V., Dyachenko N.S., Shyrshov Yu.M., Snopok B.A. Receptor site protection by specific binding: Improving of immobilisation performance. // Conference for Young Scientists and PhD Students on Molecular Biology and Genetics Dedicated to the establishment of Ukrainian Society for molecular biology. - Kyiv (Ukraine), 2001.- P.84.

14. Болтовец П.Н., Веревка С.В., Дяченко Н.С., Снопок Б.А., Ширшов Ю.М. Ориентация протеинов на поверхности сенсора: оптимизация процесса путем предварительной блокировки активного центра // 3-я международная конференция “Микроэлектронные преобразователи и приборы на их основе”. - Баку-Сумгаит (Азербайджан), 2001. – С.131.

15. Болтовец П.Н., Дяченко Н.С., Снопок Б.А., Ширшов Ю.М. Функциональные белковые архитектуры для биохимического мониторинга: ориентированная иммобилизация белков на модифицированных металлических подложках // Український біохімічний журнал. – 2002. – Т.74, №1. – С.136-137.

16. Boyko V.R., Senchugova N.A., Polishjuk V.P., Shevchenko T.P., Boltovets P.M., Hoffmann L., Kostikov I.Yu. Artificial infection of the soil green alga bracteacoccus minor by the tobacco mosaic virus // Biology and taxonomy of green algae IV, International Symposium. - Smolenice-Castle (Slovakia), 2002, Р.20.

17. Boltovets P.M., Snopok B.A., Dyachenko N.S., Shirshov Yu.M. Functionality of the protein A Staphylococcus aureus at the charged surface and its depending on the charge state of the molecule // Euresco Conference "Computational Biophysics: Integrating Theoretical Physics and Biology". - San Feliu de Guixols (Spain), 2002. - P.57.

18. Болтовец П.Н., Снопок Б.А., Лампека Я.Д., Дяченко Н.С., Ширшов Ю.М. Оптимизация биосенсора на основе поверхностного плазмонного резонанса путем модификации сенсорной поверхности пентаазамакроциклическим комплексом никеля. // Актуальные проблемы твердотельной электроники и микроэлектроники: труды 8-й международной научно-технической конференции. - Таганргог (Россия), 2002. - С.178-180.