Холодний Віталій Сергійович. Вивчення процесів, що відбуваються на різних етапах низькотемпературного консервування в суспензіях ядерних клітин кісткового мозку і кордової крові: дисертація канд. біол. наук: 03.00.19 / НАН України; Інститут проблем кріобіології і кріомедицини. - Х., 2003.
Анотація до роботи:
Холодний В.С. “Вивчення процесів, що відбуваються на різних етапах низькотемпературного консервування в суспензіях ядерних клітин кісткового мозку й кордової крові”.– Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.19 – кріобіологія. Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків, 2003.
Дисертація присвячена вивченню процесів масообміну клітин кісткового мозку й кордової крові з оточуючим середовищем на основних етапах кріоконсервування і визначенню зв'язку цих процесів із пошкодженням клітин унаслідок дії основних факторів кріопошкодження: внутрішньоклітинної кристалізації, дегідратації та регідратації.
За допомогою методів світлової мікроскопії, фізико-математичного моделювання, кріомікроскопії встановлено особливості осмотичної поведінки клітин кісткового мозку миші та кордової крові людини на всіх основних етапах кріоконсервування (експозиція клітин у кріозахисному середовищі, охолодження, заморожування та відтавання, видалення кріопротектора з клітин). Встановлено параметри, що визначають процеси масопереносу води та кріопротекторів ДМСО, 1,2 – пропадіолу, гліцерину в системі «клітина – оточуюче середовище», що зумовлюють кріозахист та кріопошкодження. З використанням методів суправітального прокрашування, аналізу кількісного та якісного складу клітинних суспензій, адгезивної здатності та фагоцитарної активності встановлено припустимі межі зміни об’єму клітин, що не призводять до падіння їх життєздатності.
Вивчення процесів масообміну в суспензіях клітин на основних етапах кріоконсервування й оцінка стійкості клітин до фізико-хімічних факторів кріопошкодження є підставою прогнозування процесу збереженості цих клітин у циклі низькотемпературного консервування. У дисертації проведене комплексне дослідження і теоретичне узагальнення явищ, що супроводжують низькотемпературне консервування ядерних клітин кісткового мозку кордової крові в присутності гліцерину, диметилсульфоксиду та 1,2-пропандіолу. Визначено біофізичні параметри, що описують ці явища, і проведено оцінку стійкості клітин до дії фізико-хімічних факторів кріопошкодження.
Методом волюмометрії з використанням модифікованої фізико-математичної моделі Кедем-Качальського визначено коефіцієнти проникності ядерних клітин кісткового мозку миші й кордової крові людини для молекул води, гліцерину, диметилсульфоксиду і 1,2-пропандіолу. Проникність плазматичних мембран для води не залежить від присутності цих кріопротекторів у розчині. Вивчені кріопротектори створюють наступний ряд за зростанням проникності крізь мембрани ядерних клітин кісткового мозку й кордової крові: гліцериндиметилсульфоксид1,2-пропандіол. Коефіцієнти проникності клітин кісткового мозку і кордової крові не залежать від напрямку трансмембранного потоку води або кріопротектора.
Значення коефіцієнтів проникності і характер об'ємних змін на етапах низькотемпературного консервування для кордової крові людини і кісткового мозку миші відрізняються незначно, що може бути підставою для використання кісткового мозку миші як моделі на етапах оптимізації методів кріоконсервування кордової крові людини.
Клітини кісткового мозку й кордової крові є стійкими до осмотичних впливів, що призводять до змін їх об'єму в діапазоні 60-125% від значення в ізотонічних умовах, та добре переносять зміни об’єму, пов'язані з одноступеневим додаванням до клітинної суспензії кріопротекторів у концентраціях 1 М для диметилсульфоксіду, 1,2-пропандиолу та 0,75 М для гліцерину.
Характерними ознаками пошкодження клітин після дегідратації є вакуолізація цитоплазми, поява трансмембранних дефектів і набрякання клітин. У випадку незахищених клітин внутрішньоклітинна кристалізація призводить до розривів мембран і втрати вмісту клітин. Присутність кріопротекторів знижує ступінь виразності цих пошкоджень. Запобігання внутрішньоклітинному кристалоутворенню шляхом зниження рівня позаклітинного переохолодження в захищених кріопротектором суспензіях є необхідним для забезпечення високого рівня збереженості клітин.
Збільшення об'єму клітин вище за початкові значення на етапі одноступеневого видалення кріопротекторів не завжди призводить до негайного порушення бар'єрних властивостей мембран у відношенні позаклітинних солей, про що свідчить динаміка осмотичної поведінки клітин на цьому етапі. Перевагою двоступеневого видалення кріопротекторів із клітинної суспензії є запобігання надмірному збільшенню об'єму, що при цьому не перевищує 125% від первісного значення (на відміну від 170-200% при одноступеневому видаленні кріопротектора). Використання гіпертонічної концентрації непроникаючої до клітин речовини в середовищі при видмиванні дозволяє повністю запобігти збільшенню клітинного об'єму.
Публікації автора:
Холодный В.С. Осмотическое поведение и транспортные характеристики плазматических мембран ядросодержащих клеток кордовой крови человека в гипертонических растворах проникающих криопротекторов // Пробл. криобиологии.– 2002, N1.– C.120-122.
Kholodnyy V.S., Rozanov L.F. Measurement of the permeability of plasma membrane of murine bone marrow cells to water and cryoprotectants // Вісн. Харк. ун-ту, №560. Біофізичний вісник.– 2002.– Вип. 1(10).– С. 73-77. (дисертантом проведене експериментальне вивчення осмотичної поведінки ядерних клітин кісткового мозку миші в розчинах хлориду натрію, ДМСО, 1,2-пропандиолу і гліцерину, на основі фізико-математичного моделювання осмотичних процесів визначено осмотично неактивний об'єм клітин, параметри проникності плазматичних мембран для води і кріопротекторів, статистична обробка та аналіз результатів).
Холодный В.С., Розанов Л.Ф. Кинетика осмотических реакций ядросодержащих клеток костного мозга мыши и кордовой крови человека на этапе удаления из них проникающего криопротектора // Пробл. криобиологии.– 2002, №3.– С. 24-29. (дисертантом проведене вивчення осмотичних процесів, що відбуваються в суспензіях ядерних клітин кісткового мозку миші й кордової крові людини при видаленні з них проникаючих кріопротекторів ДМСО, 1,2-пропандіолу і гліцерину, статистична обробка та аналіз результатів)
Останкова Л.В., Холодный В.С. Толерантность клеток костного мозга к действию осмотического стресса // Пробл. криобиологии.– 2002, №4.– С. 3-7. (дисертантом проведене вивчення впливу змін об’єму клітин кісткового мозку, викликаних експозицією клітинних суспензій у розчинах непроникаючої речовини різної осмолярності на кількісний та якісний склад суспензій, адгезівну здатність та фагоцитарну активність, статистична обробка та аналіз результатів)
Розанов Л.Ф., Смольянинова Е.И., Холодный В.С. Осмотическое поведение эмбрионов и клеток костного мозга мыши в растворах криопротекторов // Пробл. криобиологии.– 2001.– N3.– C.19-20.
Kholodnyy V.S., Rozanov L.F. Peculiarities in the Osmotic Behaviour of Murine Bone Marrow Cells during Addition and Removal of Cryoprotectant Solutions // Cryobiology.– 2001.– Vol.43, N4.– P. 386-387.
