Анотація до роботи:

Кирилюк Г.Л. Вплив кріопротекторів і режимів заморожування на механічне пошкодження клітин в області субевтектичних температур. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.19 – кріобіологія. – Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків, 2008.

Дисертаційну роботу присвячено вивченню впливу концентрацій кріопротекторів (ДМСО, гліцерин, ПЕО-1500) і режимів заморожування на пошкодження біологічних об’єктів (на прикладі клітин Saccharomyces cerevisiae, клітин диплоїдної культури людини та клітин фібробластів людини) в області субевтектичних температур у процесі кріоконсервування. На основі метода термопластичної деформації розроблена методика визначення механічних характеристик зразків і досліджені пружнопластичні властивості розчинів кріопротекторів поблизу температур їх склування. Запропоновано новий підхід до визначення оптимальних концентрацій кріопротекторних речовин при застосуванні їх у процесі кріоконсервування. Визначено порогові концентрації досліджених кріопротекторів, при яких у заморожених зразках спостерігається різка зміна співвідношення між аморфної та кристалічної фазами, тобто відокремлені одна від одної рідинні включення перетворюються у наскрізні рідинні прошарки. При кріоконсервуванні клітин S. cerevisiae і клітин культур людини спостерігається різке зростання життєздатності клітин при перевищенні порогових концентрацій кріопротекторних речовин після кріоконсервування із ДМСО, гліцерином і ПЕО-1500, що вказує на загальний характер виявленого явища. Встановлено, що одним із механізмів кріопрошкодження біооб’єктів є пластична релаксація підвищеного тиску, який виникає в окремих рідиннофазних включеннях за рахунок нерівноважної кристалізації. Визначені субевтектичні температурні інтервали та інтервали температур, де відбувається склування розчинів кріопротекторів методом термопластичної деформації. Встановлено, що ці температурні інтервали необхідно враховувати у процесі кріоконсервування для зменшення механічного пошкодження біологічних об’єктів. З обліком отриманих експериментальних даних оптимізовано режими охолодження біологічних об'єктів на прикладі клітин S. cerevisiae.

Наразі всебічно досліджено фізико-хімічні ефекти, що виникають на етапі від початку кристалізації біооб’єкту до евтектичних температур, тоді як пошкодження клітин в області субевтектичних температур майже не досліджувалось. Оскільки фазово-структурні переходи, які відбуваються в області субевтектичних температур, впливають на результат кріоконсервування і залежать від режимів охолодження - нагріву та складу кріозахисного середовища актуальним є вивчення перебігу нерівноважних фазових перетворень в області температур від температури евтектики до температури рідкого азоту та розробка нових підходів до оптимізації режимів охолодження біологічних об’єктів у цій області температур.

1. Визначено межі текучості, модулі зрушення та сумарне збільшення деформації повзучості заморожених водних розчинів ДМСО, гліцерину, ПЕО-1500, розчинів ДМСО на середовищі 199 та ДМСО на середовищі 199 з додаванням 10% ЕС поблизу температур склування цих розчинів.

2. Запропоновано новий підхід до визначення значень концентрацій розчинів кріопротекторів, за яких відокремлені одна від одної рідинні включення перетворюються у наскрізні прошарки між кристалами льоду. Ці порогові концентрації для водних розчинів ДМСО, розчинів ДМСО на середовищі 199 та розчинів ДМСО на середовищі 199 з додаванням 10% ЕС складають 5% (мас/мас), а для водних розчинів ПЕО-1500 та гліцерину - 6 і 7% відповідно.

3. Встановлено, що після заморожування та нагріву клітин S. сerevisiae та клітин культур людини (КДКЛ та КФЛ) з розчинами кріопротекторів спостерігається стрибкоподібне збільшення життєздатності клітин при досягненні концентрації ДМСО, ПЕО-1500 та гліцерину 5, 6 і 7% відповідно. Отримані результати вказують на існування загального механізму виявленого ефекту.

4. При кріоконсервуванні S. сerevisiae з водними розчинами ДМСО, гліцерину та ПЕО-1500 збільшення початкової концентрації кріопротектора у кріозахисному розчині від 3% до 5% для ДМСО, від 5% до 6% для ПЕО-1500, від 6% до 7% для гліцерину призводить до стрибкоподібного зростання життєздатності клітин на 25% для ДМСО, на 21% для ПЕО-1500 та на 18% для гліцерину.

5. Життєздатність клітин культур людини (КДКЛ та КФЛ) при кріоконсервуванні з розчинами ДМСО на середовищі 199 та ДМСО на середовищі 199 у присутності 10% ЕС стрибкоподібно збільшується у відсутності ЕС на 31% для КДКЛ та на 18% для КФЛ, а при додаванні 10% ЕС на 33% для КДКЛ та на 24% для КФЛ.

6. Розроблено оригінальний тензодилатометричний спосіб визначення кількості льоду та об’ємної частки зразка, що склується в процесі кристалізації кріозахисного середовища і залежності зміни концентрації кріопротектора у міжкристалічній рідині під час заморожування від температури.

7. Методом термопластичної деформації визначено субевтектичні інтервали температур водних розчинів кріопротекторів (ДМСО, гліцерин, ПЕО-1500), де підвищується імовірність механічного пошкодження біологічних об’єктів за рахунок пластичної релаксації підвищеного тиску, який виникає у відокремлених одне від одного рідиннофазних включеннях, а також інтервали температур склування, де відбувається пошкодження біооб’єктів за рахунок термопружних напруг.

8. З урахуванням отриманих експериментальних даних оптимізовано режими охолодження клітин S. cerevisiae і встановлено, що життєздатність цих клітин після кріоконсервування їх з водними розчинами ДМСО, гліцерину та ПЕО-1500 підвищується, якщо перетин субевтектичного температурного інтервалу здійснюється зі швидкістю охолодження 20...25С/хв, а перетин температурного інтервалу склування - зі швидкістю охолодження 1С/хв.

Публікації автора:

1. Осецкий А.И. Изучение кинетики расстеклования водных растворов криопротекторов методом термопластической деформации / А.И. Осецкий, А.Л. Кирилюк, Т.М Гурина // Проблемы криобиологии. – 2005. – Т.15, № 2. – С. 137–146.

2. Осецкий А.И. Экспериментальное определение пороговых концентраций криопротекторных веществ, обеспечивающих ингибирование механических повреждений криоконсервируемых биообъектов / А.И. Осецкий, А.Л. Кирилюк // Проблемы криобиологии. – 2005. – Т.15, № 3. – С. 245–247.

3. Кирилюк Г.Л. Теоретичне та експериментальне дослідження процесу льодоутворення в розчинах кріопротекторів методом тензодилатометрії / Г.Л. Кирилюк, В.І. Рєзников, Т.М. Гуріна // Біофізичний вісник. – 2006. – Вип.17(1). – С. 95–102.

4. Осецкий А.И. Применение метода пластической деформации для определения пороговых концентраций криопротекторных веществ при криоконсервировании Saccharomyces cerevisiae / А.И. Осецкий, А.Л. Кирилюк, Т.М. Гурина, И.П. Высеканцев // Проблемы криобиологии. – 2007. – Т.17, № 1. – С. 71–79.

5. Осецкий А.И. О возможном механизме повреждения криоконсервируемых биологических объектов за счет пластической релаксации давлений в замкнутых жидкофазных включениях / А.И. Осецкий, А.Л. Кирилюк, Т.М Гурина // Проблемы криобиологии. – 2007. – Т.17, № 3. – С. – 272–282.

6. Гурина Т.М. Влияние пороговой концентрации криозащитного раствора на жизнеспособность клеток культур человека в процессе их криоконсервирования / Т.М Гурина, А.Л. Кирилюк, Т.Ф. Петренко, Е.И. Гончарук // Експериментальна і клінічна медицина. – 2008. – №1. – С. 81–84.

7. Гурина Т.М. Влияние контролируемых скоростей охлаждения при температурах ниже -30С на жизнеспособность криоконсервированных дрожжей Saccharomyces cerevisiae / Т.М Гурина, А.Л. Кирилюк, И.П. Высеканцев // Медицина сьогодні і завтра. – 2008. – №1. – С.43–46.

8. Пат. України № 18660, МПК G 01 N 25/02 Спосіб дослідження розчинів охолоджуваних кріопротекторів / Рєзніков В.І., Кирилюк Г.Л.; заявник і патентовласник Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України. - № u 2006 05586. заявл. 22.05.06; опубл. 15.11.06. Бюл. №11.

9. Пат. України № 26502 МПК G 01 N 25/02 Спосіб дослідження розчинів кріопротекторів при заморожуванні / Оcецький О.І., Кирилюк Г.Л., Гуріна Т.М.; заявник і патентовласник Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України. - № u 2007 05234. заявл. 14.05.07; опубл. 25.09.07. Бюл. №15.

10. Осецкий А.И. Особенности кинетики расстеклования замороженных криопротекторных растворов / А.И. Осецкий, А.Л. Кирилюк, Т.М. Гурина // Проблеми біологічної і медичної фізики: I Укр. наук. конф., 20-22 вересня 2004 р.: тези доп. – Х., 2004. – С. 122.

11. Кирилюк А.Л. Влияние колебаний температуры хранения в диапазоне -196С…-100С на жизнеспособность клеток с различной структурной организацией / А.Л. Кирилюк, Л.Г. Абрафикова, С.В. Казанжан // Холод в биологии и медицине: конф. молодых ученых ИПКиК НАН Украины, 17-18 мая, 2005 р.: тезисы докл. – Х., 2005. – С. 10.

12. Kyryliuk A.L. Physical substantiation of three-step freeze-thawing as optimal regimen for changing temperature during biological system cryopreservation / A.L. Kyryliuk, A.I. Osetsky, T.M. Gurina // Cryo-2006: 43rd Annual Meeting of the Society for Cryobiology, July 24-27, 2006 y.: abstract. – Hamburg, 2006. – Р. 15.

13. Высеканцев И.П. Роль контролируемых скоростей охлаждения в субэвтектическом температурном интервале при криоконсервировании криолабильных микроорганизмов / И.П. Высеканцев, Т.М. Гурина, А.Л. Кирилюк // Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии: VI Междунар. науч. конф., 2-6 июня, 2008 г.: материалы конф. – Минск, 2008. – С. 45–46.