Боброва Олена Миколаївна. Вплив кріопротекторів і низьких температур на термодинамічні параметри та структурний стан компонентів кордової крові і плаценти людини : Дис... канд. наук: 03.00.19 - 2007.
Анотація до роботи:
Боброва О.М.. Вплив кріопротекторів і низьких температур на термодинамічні параметри та структурний стан компонентів кордової крові і плаценти людини. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за фахом 03.00.19 – кріобіологія. – Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків, 2007.
Дисертаційна робота присвячена дослідженню впливу 1,2-пропандіолу (1,2-ПД), гліцерину (Гл) і диметилсульфоксиду (ДМСО) на фазові переходи і склування в компонентах фетоплацентарного комплексу нижче 0С, динаміки насичення плаценти кріопротекторами, а також впливу режимів еквілібрації з кріопротекторами і заморожування-відтавання на структурний стан еритроцитів кордової крові.
Отримані методом ДСК результати свідчать про те, що в присутності 1,2-ПД, Гл і ДМСО однакових концентрацій склуються різні кінетичні одиниці, при цьому стабільність аморфного стану найбільш висока в присутності 1,2-ПД; висока щільність клітин сприяє утворенню склоподібних фаз при охолодженні, призводить до процесу кристалізації з аморфної фази при нагріванні і пригнічує процес кристалізації евтектичних складів. Виявлено, що зростання концентрації Гл і 1,2-ПД викликає набрякання еритроцитів, а ДМСО - кренування. Встановлено оптимальні температури еквілібрації еритроцитів КК у розчинах кріопротекторів: Гл - 20С; 1,2-ПД і ДМСО - 0С. Методом ЕПР показано порушення бар'єрних функцій мембран еритроцитів кордової крові в присутності 30% ДМСО і 40% Гл та 1,2-ПД. Вивчення динаміки насичення плаценти кріопротекторами показало, що процес насичення тканини кріопротектором має двохфазний характер.
У дисертаційній роботі викладено теоретичне й експериментальне узагальнення наукової задачі, спрямованої на вивчення впливу 1,2-ПД, Гл і ДМСО на низькотемпературні фазові переходи і склування компонентів фетоплацентарного комплексу, а також на структурний стан еритроцитів кордової крові.
Установлено закономірності розвитку кристалічних і склоподібних фаз у суспензії еритроцитів, надосадовій рідині і щільному осаді еритроцитів, а також у плазмі крові і плаценті людини в залежності від виду і концентрації проникного кріопротектора в температурному діапазоні 0 - 196C.
Показано, що стрибок теплоємності при переході системи з твердоаморфного стану в стан переохолодженої рідини істотно відрізняється в досліджених систем, указуючи на те, що в присутності 1,2 – ПД, Гл або ДМСО однакових концентрацій склуються різні кінетичні одиниці. Серед досліджених кріозахисних речовин стабільність аморфного стану найвища в присутності 1,2-ПД. Встановлено, що в умовах використання низькомолекулярних кріопротекторів, що мають коефіцієнт розподілу між внутрішньо- і позаклітинним середовищем близький до одиниці, висока щільність клітин сприяє склуванню внутрішньоклітинної рідини.
У системах, що містять ДМСО, на відміну від систем з кріопротекторами з ряду поліолів спостерігається кристалізація евтектичних складів. Це явище, поряд із кристалізацією льоду з аморфної фази нижче 0C, являє собою додатковий фактор кріопошкодження.
Виявлено, що біологічні компоненти пригнічують розвиток процесів кристалізації і плавлення евтектичних складів у присутності ДМСО. При збільшенні кількості клітин у суспензії еритроцитів спостерігається посилення цієї пригнічуючої дії. Встановлено, що системи, які містять біологічні компоненти і кріопротектори, більш схильні до утворення аморфних фаз при охолодженні і до розвитку кристалізації води з аморфної фази при нагріванні, ніж водні розчини кріопротекторів відповідних концентрацій.
Вперше методами ДСК і ЯМР досліджена динаміка насичення плаценти кріозахисними речовинами - Гл, 1,2-ПД і ДМСО. Показано, що процес насичення тканини кріопротектором має двохфазний характер, зумовлений неодночасним насиченням поза- і внутрішньоклітинного простору. Показано, у фрагментах плаценти, охолоджених до-196С після їх еквілібрації протягом 60 хв у розчинах, що містять 60 мас. % Гл або 1,2-ПД, не розвиваються процеси кристалізації з аморфної фази при нагріванні. Це свідчить про те, що концентрація зазначених кріопротекторів у плаценті не досягає 40мас. %. Більш тривала еквілібрація сприяє затвердінню зразка в склоподібному стані при охолодженні і формуванню дрібнодисперсного льоду при нагріванні. Експериментально виявлено, що після 18 годин еквілібрації плаценти в розчинах ДМСО 40 і 60 мас. % спостерігається зменшення вмісту ДМСО в плаценті.
При заморожуванні еритроцитів з середньою швидкістю 200 С/хв у присутності Гл і 1,2-ПД максимальне збереження спостерігається в діапазоні концентрацій 20 30 мас %, а з ДМСО – 10 20 мас %. Наявність оптимальних концентрацій кріопротекторів пояснюється тим, що, з одного боку, зростання концентрації кріопротектора призводить до збільшення кількості склоподібної фази, знижуючи тим самим дію пошкоджуючих ефектів, зв'язаних з льодоутворенням, однак, з іншого боку, підвищує токсичність кріопротекторів.
Показано, що зростання концентрації Гл і 1,2-ПД викликає набрякання еритроцитів. У присутності 3040 мас % Гл спостерігається утворення стоматоцитарних форм, у присутності 1,2-ПД в тих же концентраціях – кренованих форм клітин. ДМСО у всьому дослідженому діапазоні концентрацій призводить до кренованості клітин. При досягненні концентрації ДМСО 30 мас % морфологічним змінам піддаються всі клітини в суспензії. Встановлено оптимальні температури еквілібрації еритроцитів КК у розчинах кріопротекторів, що складають для Гл - 20С, для 1,2-ПД і ДМСО - 0С.
Виявлено збільшення проникності мембран еритроцитів кордової крові для іонів феріціаниду в присутності кріопротекторів високих концентрацій (Гл , 1,2 - ПД – більше 40 мас % і ДМСО – більше 30 мас %), що пов'язано з порушенням бар'єрної функції мембран еритроцитів. Виявлено пошкоджуючу дію низькотемпературних фазових переходів розчинника на бар'єрні функції мембран еритроцитів. Зменшення мікров'язкості цитоплазми після заморожування еритроцитів у присутності Гл може свідчити про набрякання клітин, що підтверджується дослідженнями методом РЕМ.
Публікації автора:
Зинченко А.В., Боброва Е.Н., Щетинский М.И. Влияние ДМСО на фазовые переходы и стеклование в суспензии эритроцитов кордовой крови ниже 0С // Проблемы криобиологии. - 2003. - № 2. - С. 16-21.
Зинченко А.В., Боброва Е.Н., Щетинский М.И. Влияние глицерина и 1.2-пропандиола на фазовые переходы и стеклование в суспензии эритроцитов кордовой крови при температуре ниже 0С // Доповіді НАН України. - 2003. - №12. - С. 155-160.
Зинченко А.В., Боброва Е.Н. Фазовые переходы и стеклование в экстрактах плаценты с добавками криопротекторов при температуре ниже 0С // Актуальные проблемы медицины и биологии. Сб. науч. работ. Киев: КНМУ, 2004. - №1 – С. 93–97.
Боброва А.В., Зинченко А.В., Коваленко Г.В. Криомикроскопические исследования замораживания–оттаивания суспензий эритроцитов кордовой крови в присутствии глицерина, 1,2-пропандиола и диметилсульфоксида // Міжвідомчий збірник “Гематологія і переливання крові”. – 2004. -Вип. №32, част. 1. – С. 7–12.
Боброва Е.Н., Зинченко А.В., Щетинский М.И. Исследование насыщения ткани плаценты глицерином и 1,2-пропандіолом // Проблемы криобиологии. - 2005. - № 2. - С. 147-152.
Боброва Е.Н, Зинченко А.В. О кристаллизации воды из аморфной фазы в суспензиях эритроцитов кордовой крови при охлаждении и нагреве с 1.2-пропандиолом и глицерином // Проблемы криобиологии. -2002. - № 1. - С. 122-123.
Зінченко О.В., Боброва О.М., Смирнов Я.В. Кристалізація і склування в суспензії еритроцитів кордової крові в присутності гліцерину та 1.2-пропандіолу в діапазоні температур 0 -196С // Тези доп. 3 з'їзду Укр. біофізичного товариства, м. Львів, Україна, 8-11 жовт. 2002. - С. 224.
Zinchenko A.V., Bobrova E.N. Low-temperature phase transition and glass transition in cord blood erythrocytes suspensions in dependence on 1,2-propanediol and glycerol concentration // Proc. Internat. Conf. Cryobiomol 2003. Low temperature biology, Coimbra – Portugal. 14-18 sept. 2003. - P. 160.
Боброва Е.Н., Зинченко А. В. Физические состояния суспензий эритроцитов кордовой крови в присутствии ДМСО ниже 0C // Тези доп. І Укр. наук. конференції «Проблеми біологічної і медичної фізики», м. Харків, Україна, 20-22 вересня 2004 р. - С. 167.
Боброва Е.Н., Цымбал Л.В., Зинченко А.В. Влияние низких температур и неэлектролитов на проницаемость мембран эритроцитов для парамагнитных ионов // Материалы V Харьковской конференции молодых ученых «Радиофизика и СВЧ электроника», г. Харьков, Украина, 14 – 16 дек. 2005. - С.46.
Боброва О.М., Рєпін М.В., Зінченко О.В Морфофункціональні параметри еритроцитів кордової крові при додаванні кріопротекторів // Збірник тез Другої міжнародної наукової конференції студентів і аспірантів “Молодь та поступ біології”, м. Львів, Україна, 21-24 бер. 2006. – С.4.
Боброва Е.Н., Репин Н.В., Зинченко А.В. Влияние проникающих криопротекторов на морфологическое состояние эритроцитов кордовой крови // Материалы Второй всеукр. научн.-техн. конференции «Актуальные вопросы теоретич. и прикладной физики и биофизики», г. Севастополь, Украина, 17-22 апр. 2006. С. 85-87.
Боброва О.М., Репін Н.В., Зінченко О.В. Морфофункціональні параметри еритроцитів кордової крові при додаванні кріопротекторів // Збірник тез Другої міжнародної наукової конференції студентів і аспірантів“Молодь та поступ біології”, м. Львів, Україна, 21-24 бер. 2006. С.4.
