Анотація до роботи:

Черкашина Я.О. Вплив кріопротекторів і модифікаторів цитоскелет-мембранного комплексу на стан еритроцитів в умовах осмотичного і температурного шоку.- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за фахом 03.00.19 – кріобіологія. Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків, 2006.

Дисертаційна робота присвячена вивченню впливу кріопротекторів, модифікаторів мембрани і цитоскелета і інгібітору транспорту аніонів на чутливість еритроцитів до зміни осмотичних і температурних умов середовища.

Хімічну модифікацію еритроцитів здійснювали шляхом обробки клітин ЙАА, ПХМБ, NЕМ. Модифікацію іонного транспорту проводили за допомогою інгібітору аніонного транспорту діпірідамолу. Середовища, які використовували містили натрієві солі хлориду, сульфату, і сахарозу, а також кріопротектори (ПЕГ-3000, ПЕГ-1500, ПЕГ-400, гліцерин, 1,2-пропандіол, ДМСО).

Отримані в роботі результати свідчать про те, що непроникаючі кріопротектори знижують чутливість еритроцитів людини до гіпертонічного кріогемолізу упродовж всього часу інкубації, в той час, як проникаючі кріопротектори зменьшують рівень гіпертонічного кріогемолізу на початковому етапі інкубації в електролітному середовищі. Встановлено, що модифікація мембран еритроцитів ЙАА та ПХМБ приводить до елімінації мембранного температурного переходу при 9±1 ^оС. Показано, що інкубація клітин в середовищах, що містять кріопротектори (ПЕГ-3000, ПЕГ-1500, ПЕГ-400, гліцерин, 1,2-пропандіол, ДМСО), не приводить до значних змін швидкості транспорту іонів Н⁺ в еритроцити, але викликає підвищення швидкості звільнення іонів Н⁺ в процесі роботи циклу Якобса-Стюарта.

В дисертаційній роботі подано теоретичне та експериментальне узагальнення наукової проблеми, що відноситься до розкриття механізмів гіпертонічного кріогемолізу клітин і розробки підходів, які спрямовані на підвищення стійкості клітин до зміни осмолярності середовища шляхом підбору компонентів, які забезпечують мінімальне пошкодження клітин та при зміни функціонального стану аніонного транспортера, що контролює чутливість клітин до зміни осмотичних параметрів середовища.

1. Непроникаючі кріопротектори (поліетиленгліколь-3000 і поліетиленгліколь-1500) знижують чутливість еритроцитів до гіпертонічного кріогемолізу в середовищах, що містять 1,2 Моль/л NaCl і 0,86 Моль/л сахарози. При цьому поліетиленгліколь-3000 змінює динаміку розвитку чутливость еритроцитів до гіпертонічного кріогемолізу в середовищі, що містить 1,2 Моль/л NaCl.

   Проникаючі кріпротектори (гліцерин, діметилсульфоксид, 1,2-пропандіол і поліетиленгліколь-400) знижують чутливісті еритроцитів до гіпертонічного кріогемолізу в середовищі, що містить 1,2 Моль/л NaCl на початковому етапі інкубації, із наступним зростанням чутливості при подовженні тривалості інкубації. При цьому найбільш виражену захисну дію виявляють 1,2-пропандіол і поліетиленгліколь-400. Слід зазначити, що поліетиленгліколь-400 змінює динаміку розвитку гіпертонічного кріогемолізу у електролітному середовищі (1,2 Моль/л NaCl). В середовищі, що містить 0,86 Моль/л сахарози, всі проникаючі кріопротектори (гліцерин, діметилсульфоксид, 1,2-пропандіол і поліетиленгліколь-400) зменшують рівень гіпертонічного кріогемолізу.

   Обробка модифікаторами сульфгідрильних груп йодоацетамідом і парахлормеркурійбензоатом приводить до підвищення чутливості еритроцитів до гіпертонічного кріогемолізу як у відсутності кріопротекторів, так і в середовищах, що їх містять, при цьому динаміка розвитку цього процесу, яка властива кожному з кріопротекторів, не змінюється.

   Дія на еритроцити йодоацетаміда і парахлормеркурійбензоата супроводжується елімінацією температурного переходу при 9±1 ^оС у плазматичній мембрані, тоді як обробка N-етилмалеімідом спричиняє зміни в динамічній структурі мембрани, що пов`язані зі структурним переходом при температурі 9±1 <sup>о</sup>С. При обробці еритроцитів йодоацетамідом і N-етилмалеімідом зменшується діелектрична проникність суспензії еритроцитів, що свідчить про підвищення кількості зв`язаної води в суспензії клітин.

   Заміна внутрішньоклітинних аніонів Cl^- на аніони F^- приводить до зниження здатності діпірідамолу інгібувати транспорт іонів Н⁺ і SO₄^2- в еритроцитах, а також до зниження швидкості транспорту через мембрану іонів Н⁺ . Це підтверджує той факт, що для зв`язування діпірідамолу з аніонним каналом необхідні іони Cl^-.

   У присутності поліетиленгліколя-1500 (15%) і сахарози (15%), має місце інгібування транспорту іонів Н⁺ і SO₄^2- в еритроцити. Поліетиленгліколь-1500 зменшує вплив діпірідамолу на досліджений транспорт іонів, а сахароза, навпаки, посилює. При зв`язуванні з мембраною поліетиленгліколь-1500 може перешкоджати контакту діпірідамолу з мембраною і, відповідно, входу інгібітору в аніонний канал. Під впливом поліетиленгліколя-1500 може відбуватися перерозподіл інгібітору з мембрани в розчин.

   Показано, що інгибування еритроцитів у гіпертонічному середовищі (1,2 Моль/л NaCl), що містить кріопротектори (поліетиленгліколь-3000, поліетиленгліколь-1500, поліетиленгліколь-400, гліцерин, 1,2-пропандіол, діметилсульфоксид), не приводить до значних змін швидкості транспорту іонів Н⁺ в еритроцити, але майже у два рази підвищує швидкість звільнення іонів Н⁺ в процесі роботи циклу Якобса-Стюарта.

Публікації автора:

1. Рамазанов В.В., Нардид Я.О., Олейник О.А., Бондаренко В.А. Влияние ПЭГ-1500 на связывание дипиридамола с анионным каналом эритроцитов // Проблемы криобиологии и криомедицины. – 2003. – №4. – С. 12-19.

2. Цымбал Л.В., Нардид Я.О. Проницаемость мембран эритроцитов, модифицированных высокими температурами и сульфгидрильными реагентами // Актуальные проблемы медицины и биологии – 2004. – №1. – С. 185-189.

3. Цымбал Л.В., Нардид Я.О. Немонотонность температурно-зависимых параметров динамической структуры мембран эритроцитов. Влияние модификации SH-групп белков // Біофізичний вісник. – 2004. – Вип. 1-2. – №14. – С. 76-84.

4. Нардид Я.О., Даниленко Н.А., Рамазанов В.В., Бондаренко В.А. Влияние хлорида алюминия и различных криопротекторов на развитие гипертонического криогемолиза эритроцитов человека // Проблемы криобиологии. – 2005. – Т.15, - С. 607-613.

5. Даниленко Н.А., Черкашина Я.О., Рамазанов В.В., Бондаренко В.А. Влияние хлорида алюминия и ПЭГ-1500 на чувствительность эритроцитов человека к изменению осмотических и температурных параметров среды // Вісник проблем біології і медицини. – 2006. – Вип. 2 – С. 42-45.

6. Цымбал Л.В., Шпакова Н.М., Орлова Н.В., Нардид Я.О. Возможная роль полиморфизма биологических мембран в реакциях клеток на физико-химические воздействия // Сб. статей Международной научной конференции «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем». Ч. 1. – Минск, 2004. – С. 281-283.

7. Цымбал Л.В., Черкашина Я.О. Температурно-зависимая динамика спин-меченной жирной кислоты в суспензии эритроцитов // Сб. статей Международной научной конференции «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» Ч. 1 – Минск, 2006. – С. 319-321.

8. Нардид Я.О., Цымбал Л.В. Структурно-функциональное состояние мембраны эритроцитов при окислении сульфгидрильных групп белков // Зб. Тез I Української наукової конференції «Проблеми біологічної і медичної фізики». – 2004. – С. 125.

9. Нардід Я.О., Цимбал Л.В. Вплив модифікаторів білків на структурні переходи ліпідів у мембранах еритроцитів // Зб. Тез Установчого з`їзду українського товариства клітинної біології. – Львів, 2004. – С. 55.

10. Даниленко Н.А., Нардид Я.О. Особенности развития гипертонического криогемолиза эритроцитов человека в средах, содержащих хлорид алюминияи ПЭГ-1500 // Зб. Тез 9-ї Міжнародної конференції молодих вчених «Биология – наука XXI века». – Пущино, 2005. – С. 160.

11. Нардід Я.О., Даниленко Н.А. Дослідження гіпертонічного кріогемолізу еритроцитів людини в електролітних та неелектролітних середовищах при дії хлориду алюмінію та різних кріопротекторів // Зб. Тез I Міжнародної наукової конференції студентів та аспірантів "Молодь і поступ біології". – Львів, 2005. – С. 25.

12. Нардид Я.О., Цымбал Л.В. Температуро-зависимые переходы в мембране эритроцитов при воздействии модификаторов мембранных белков // Проблемы криобиологии и криомедицины: Тезисы докладов. – 2005. – Т. 15. – №4. – С. 750-751.

13. Даніленко Н.А., Черкашина Я.О. Вплив діпірідамолу на функціональну активність аніон-транспортної системи еритроцитів людини при дії ПЕГ-1500 та хлориду алюмінію // Зб. Тез II Міжнародної наукової конференції студентів та аспірантів "Молодь і поступ біології". – Львів, 2006. - С. 42-45.

14. Черкашина Я.О., Бондаренко В.А. Влияние модификаторов сульфгидрильных групп на структурно-функциональное состояние мембраны эритроцитов // Зб. Тез IX Українського біохімічного з`їзду. – Харків, 2006. – С. 69-70.