Анотація до роботи:

Кордиш М.О. Внутрішньомолекулярна конформаційна рухливість та РНК-зв’язувальні властивості С-модуля еукаріотної тирозил-тРНК синтетази і цитокіну ЕМАР ІІ. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.03 – молекулярна біологія. - Інститут молекулярної біології та генетики НАН України. – Київ. – 2007.

Досліджено внутрішньомолекулярну конформаційну рухливість ізольованого С-модуля TyrRS та цитокіну ЕМАР ІІ в розчині методами флуоресцентної спектроскопії, кругового дихроїзму та молекулярної динаміки, а також охарактеризовані конформаційні зміни цих білків під впливом температури. Проаналізовано формування комплексів С-модуля TyrRS та цитокіну ЕМАР ІІ із тРНК методами стаціонарної та з роздільністю у часі флуоресцентної спектроскопії, а також методами молекулярного моделювання. Визначено параметри зв’язування тРНК з досліджуваними білками. Експериментально досліджено ймовірні механізми взаємодії С-модуля та ЕМАР ІІ з тРНК, виявлено конформаційні зміни білків при утворенні комплексів з тРНК та охарактеризовано можливі механізми таких змін.

В дисертаційній роботі вивчено внутрішньомолекулярну конформаційну рухливість та РНК-зв’язувальні властивості С-модуля тирозил-тРНК синтетази і цитокіну ЕМАР ІІ. Проаналізовано можливі механізми взаємодії цих білків з тРНК та їхні конформаційні зміни при комплексоутворенні.

1. Встановлено внутрішньомолекулярну локалізацію залишку Trp144 в просторовій структурі С-модуля та виявлено швидку конформаційну рухливість мікрооточення Trp144 в наносекундному часовому інтервалі.

2. Mоніторинг залежних від температури конформаційних змін С-модуля з використанням флуоресценції Trp144 виявив конформаційний перехід мікрооточення Trp144 в діапазоні температур 37-52^оС, який характеризується виходом Trp144 із зануреного всередину глобули стану до стану, експонованого до швидкорелаксуючого полярного розчинника.

3. Методами флуоресцентної спектроскопії показано, що Trp125 EMAP II є частково експонованим до розчинника при 37^оС, а його повний вихід у швидкорелаксуюче водне оточення здійснюється при 45^оС.

4. Методами білкової інженерії отримано С-модуль TyrRS із заміною Phe127 на флуорофор Trp127. Досліджено формування комплексів С-модуля і ЕМАР ІІ з тРНК та визначено параметри зв’язування тРНК з білками в цих комплексах. Показано, що на відміну від Trp144 С-модуля, Trp125 EMAP II та Trp127 мутантного С-модуля залучені до взаємодії з тРНК.

5. Аналіз даних флуоресцентного перенесення енергії між флуорофором Trp144 С-модуля та Y-нуклеозидом тРНК^Phe вказує на віддаленість Trp144 від Y-нуклеозида на r>1,4 нм, що узгоджується з моделлю тривимірної структури комплексу, в якій С-модуль TyrRS взаємодіє в області акцепторного стебла та D-петлі тРНК.

6. Порівняльний аналіз параметрів затухання флуоресценції вільного С-модуля та його комплексу з тРНК дозволив виявити додаткову короткоживучу компоненту триптофанової флуоресценції в присутності тРНК, яка, ймовірно, обумовлена конформаційними змінами білка. Аналіз запропонованої моделі комплексу свідчить, що механізм гасіння флуоресценції Trp127 може бути обумовлений стабілізацією карбоксильної групи Glu128 за рахунок формування цим залишком нових водневих зв’язків при взаємодії з тРНК.

Публікації автора:

1. Кордыш М.А., Одынец К.А., Корнелюк А.И. Trp144 как флуоресцентный зонд для изучения конформационной подвижности С-модуля эукариотической тирозил-тРНК синтетазы // Біополімери і клітина.–2003.–Т. 19, № 5.–С. 436-439. Особистий внесок здобувача: автором охарактеризовано та проаналізовано мікрооточення залишку Trp144, виявлена його швидка конформаційна рухливість за допомогою методів флуоресцентної спектроскопії та комп’ютерного моделювання.

2. Кордыш М.А., Корнелюк А.И. Флуоресценция и динамика структурного окружения флуорофора Trp125 в цитокине EMAP II // Вестник Харьковского национального университета им. В.Н. Каразина.: Биофизический вестник.–2003.–Т.2, №13.–С.86-90. Особистий внесок здобувача: охарактеризовано мікрооточення залишку Trp125 та степінь доступності поверхні даного залишку молекулам розчинника на основі власноруч отриманих даних флуоресцентної спектроскопії та комп’ютерного моделювання.

3. Кордыш М.А., Корнелюк А. И. Мониторинг конформационного изменения окружения флуорофора Trp144 в С-модуле тирозил-тРНК синтетазы при тепловой денатурации // Доповіді НАН України.–2004.–№1.- С. 156-161. Особистий внесок здобувача: проведено та проаналізовано температурно індуковане гасіння флуоресценції Trp144.

4. Кордиш М.О., Дубровський О.Л., Корнелюк О.І. Локальний конформаційний перехід флуорофора Trp125 в цитокіні EMAP II, індукований фізіологічною температурою // Фізика живого. - 2005. – Т. 13, №1. – С. 79-85. Особистий внесок здобувача: отримано та проаналізовано ефект крайового зсуву флуоресценції Trp 125 EMAP II при тепловій денатурації.

5. Kordysh M., Kornelyuk A, Conformational flexibility of cytokine-like C-module of tyrosyl-tRNA synthetase monitored by Trp144 intrinsic fluorescence // J. Fluoresc. – 2006. – Vol. 16 – P. 705-711. Особистий внесок здобувача: проведено експресію С-модуля TyrRS; отримано та проаналізовано: параметри флуоресценції Trp144, дані гасіння флуоресценції білка зовнішніми гасниками, дані температурно-індукованих конформаційних змін мікрооточення Trp144 методом крайового зсуву флуоресценції.

6. Кордиш М.О., Корнелюк О.І. Вивчення взаємодії С-модуля тирозил-тРНК синтетази з тРНК методами флуоресцентної спектроскопії // Біополімери і клітина.–2006.–Т. 19, № 5.–С. 436-439. Особистий внесок здобувача: за безпосередньої участі автора проведено сайт-спрямований мутагенез Phe127 на Trp127 С-модуля, експресію та очистку даного білка, визначено параметри зв’язування комплексу С-модуля з тРНК^Phe.

7. Кордиш М.О., Кирюшко Г.В., Мелі І., Корнелюк О.І. Дослідження конформаційної рухливості С-модуля тирозил-тРНК синтетази та його комплексу з

тРНК методами часороздільної флуоресцентної спектроскопії // Біополімери і клітина. –2007. –Т. 23, № 2.– С. 130-136. Особистий внесок здобувача: отримано та проаналізовано параметри затухання флуоресценції С-модуля TyrRS та ЕМАР ІІ без та в присутності тРНК^Phe.

8. Кухар М.О., Одинець К.О., Корнелюк О.І. Флуоресценція Trp144 як зонд для вивчення конформаційної динаміки С-кінцевого цитокіноподібного модуля еукаріотичної тирозил-тРНК синтетази // Тези доповідей: ІІІ З’їзд Українського біофізичного товариства. – Львів. - 2002. - С. 59. Особистий внесок здобувача: отримано та проаналізовано температурну залежність триптофанової флуоресценції С-модуля.

9. Kordysh M., Kornelyuk A. Fluorescence spectroscopic study of the conformational changes in EMAP II cytokine // Abstract book: Conference for Students, PhD-students and young scientists on Molecular Biology and Genetics, dedicated to the golden jubilee of the double helix and 30 anniversary of the Institute of Molecular Biology and Genetics of NAS of Ukraine. – Kyiv.- 2003.–P. 84. Особистий внесок здобувача: отримано та проаналізовано спектри флуоресценції Trp125 ЕМАР ІІ при тепловій денатурації.

10. Kordysh M., Kornelyuk A. Monitoring of temperature-induced conformational changes of a Trp 144 microenvironment in cytokine-like C-module of mammalian tyrosyl-tRNA Synthetase // Abstract book: 5th International Conference on Biological Physics. - Gothenburg, Sweden. -2004. - P.99. Особистий внесок здобувача: автором проведено моніторинг температурно-індукованих конформаційних змін С-модуля, використовуючи власну флуоресценцію Trp144.

11. Кордиш М.О., Корнелюк О.І. Локальний конформаційний перехід та експонування Trp125 в цитокіні ЕМАР ІІ при фізіологічній температурі // Тези доповідей: Перша Українська наукова конференція “Проблеми біологічної і медичної фізики”. – Харків.- 2004.- С.31. Особистий внесок здобувача: методами флуоресцентної спектроскопії виявлено локальний конформаційний перехід залишку Trp125 при 37^оС.

12. Кордыш М.А., Ковальский Д.Б., Дубина В.М., Корнелюк А.И. Изучение стабильности закрытой конформации Trp125 цитокина ЕМАР ІІ методом молекулярной динамики // Тези доповідей: Перша Українська наукова конференція “Проблеми біологічної і медичної фізики”. – Харків.- 2004.- С.78. Особистий внесок здобувача: аналіз конформаційних змін цитокіну ЕМАР ІІ на основі проведенних розрахунків МД.

13. Kordysh M., Kornelyuk A. Red-edge excitation fluorescence studies of the fast intramolecular dynamics of EMAP II cytokine // European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 15^th IUPAB & 5^th EBSA International Biophysics Congress.- Montpellier, France.- 2005.- P. 615. Особистий внесок здобувача: методом крайового зсуву флуоресценції досліджено внутрішньомолекулярну динаміку мікрооточення Trp125 ЕМАР ІІ цитокіну.

14. Кордиш М.О., Сурова О.В., Корнелюк О.І. Сайт-спрямований мутагенез Phe127Trp в РНК- зв’язуючому центрі ізольованого С-модуля тирозил-трНК синтетази та дослідження взаємодії з тРНК методом флуоресцентної спектроскопії // Тези доповідей: IV З’їзд Українського Біофізичного товариства. – Донецьк. – 2006. - С.302. Особистий внесок здобувача: за безпосередньої участі автора проведено сайт-спрямований мутагенез Phe127 на Trp127 С-модуля; автором за допомогою методів флуоресцентної спектроскопії визначено параметри зв’язування комплексу С-модуля з тРНК^Phe.