Анотація до роботи:

Вац Ю.О. Властивості Са²⁺-помпи мембран ацинарних секреторних клітин підщелепної слинної залози щурів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.13 - фізіологія людини і тварин. – Львівський національний університет імені Івана Франка, Львів, 2004.

Дисертація присвячена комплексному вивченню властивостей Са²⁺-АТФаз плазматичної та ретикулярної мембран клітин підщелепної слинної залози щурів.

На ізольованих ацинусах показано, що Са²⁺-гомеостаз у клітині підтримується за рахунок узгодженої роботи Са²⁺-помп та каналів плазматичної мембрани секреторних клітин слинних залоз.

В інтегральній фракції inside-out орієнтованих везикул слинної залози ідентифіковано тапсигаргін-нечутливу Са²⁺-АТФазу плазматичної та тапсигаргін-чутливу Са²⁺-АТФазу ретикулярної мембран. Ідентифіковано високо- та низькоафінні центри зв’язування АТФ та Са²⁺ з Са²⁺-АТФазами. Здатність катіонів заміняти Са²⁺ та Mg²⁺, та інших нуклеотидів заміняти АТФ у роботі Са²⁺-АТФаз плазматичної та ретикулярної мембран знаходиться у послідовності: Са²⁺=Ba²⁺>Sr²⁺ та Са²⁺=Ba²⁺=Sr²⁺; Mg²⁺>Mn²⁺>Co²⁺>Cu²⁺ та Mg²⁺=Mn²⁺>Cu²⁺>Co²⁺; АТФ>ГТФ>УТФ>ЦТФ та АТФ>ГТФ>ЦТФ>УТФ відповідно. Інгібітори пригнічують Са²⁺-АТФази: еозин Y > ПХМБ > La³⁺. Виявлено, важливу роль імідазольної групи гістидину та SH-групи цистеїну АТФ-зв’язуючого центру у роботі Са²⁺-АТФаз.

1. Оскільки дані щодо властивостей Са²⁺-АТФаз мембран секреторних клітин слинних залоз є малочисельні, у дисертації із використанням комплексу методів проведено всебічне дослідження Са²⁺-помп клітин слинних залоз щурів, що включає ідентифікацію активності Са²⁺-АТФаз ПМ та ЕПР, вивчення їх властивостей, механізмів модифікації та ролі у внутрішньоклітинній Са²⁺-сигналізації.

2. Узгоджене функціонування Са²⁺-помп мембран ацинарних клітин слинних залоз відіграє важливу роль у підтриманні внутрішньоклітинного Са²⁺-гомеостазу та Са²⁺-залежної базальної секреції.

3. Основні кінетичні параметри роботи Са²⁺-АТФаз клітин підщелепної слинної залози становлять: початкова швидкість V₀ - 0,1 ± 0,01 мкмоль Р_і/хв на 1 мг білка, максимальна кількість продукту реакції Р_max - 0,8 ± 0,1 мкмоль Р_і/мг білка, характеристичний час ферментативної реакції - 6,8 ± 0,4 хв.

4. Ідентифіковано високо- та низькоафінні центри зв’язування АТФ та Са²⁺ з Са²⁺-АТФазами мембран досліджуваних клітин. Показано участь високоафінного АТФ-зв’язуючого центру у ферментативній реакції, а в транспорті Са²⁺ - низькочутливої компоненти Са²⁺-залежного гідролізу АТФ.

5. Здатність двовалентних катіонів заміняти Са²⁺ у функціонуванні Са²⁺-АТФаз ПМ та ЕПР знаходиться у послідовності: Са²⁺=Ba²⁺>Sr²⁺ та Са²⁺=Ba²⁺=Sr²⁺. Нами вперше показано пригнічення активності Са²⁺-АТФаз ПМ та ЕПР клітин слинної залози при заміні Mg²⁺ (Mg²⁺>Mn²⁺>Co²⁺>Cu²⁺ та Mg²⁺=Mn²⁺>Cu²⁺>Co²⁺). Здатність інших нуклеотидів заміняти АТФ у роботі Са²⁺-АТФаз ПМ та ЕПР зменшується у послідовності: АТФ>ГТФ>УТФ>ЦТФ та АТФ>ГТФ>ЦТФ>УТФ відповідно.

6. Са²⁺-АТФази мембрани секреторних клітин пригнічуються еозином Y, La³⁺ та ПХМБ. На основі значень рК та інгібіторного аналізу постулюється важлива роль імідазольної групи гістидину, SH-групи цистеїну, СОО^-_груп глутамінової та аспарагінової кислот у функціонуванні Са²⁺-АТФаз.

7. Сульфгідрильний реагент ПХМБ знижує спорідненість Са²⁺-АТФаз до АТФ, проте не впливає на спорідненість до Са²⁺. Виявлено в складі їх молекул як поверхневих, так і прихованих SH-груп. Показано неконкурентний спосіб взаємодії ПХМБ з каталітичним центром Са²⁺-АТФаз.

8. Показано, що при експериментальному діабеті (як моделі розвитку ксеростомії) порушується робота Са²⁺-АТФаз мембрани ацинарних клітин слинних залоз, в основі чого, очевидно, є зменшення кількості обертів молекули і зміни кальцієвої та субстратної регуляції активності ферменту.

Публікації автора:

1. Fedirko N., Klevets M., Vats Ju. Isolated acini as an object for the investigation of the Ca²⁺-transporting system of the secretory cell membranes. // Neurophysiology. - 2000. - Vol. 32. - P. 183-184. (Здобувач провів дослідження та статистичне опрацювання експериментальних даних.)

2. Федірко Н.В., Клевець М.Ю., Кругліков І.А., Вац Ю.О. Зміни концентрації катіонів кальцію у секреторних клітинах ізольованих ацинусов підщелепної слинної залози щурів під впливом ацетилхоліну та норадреналіну // Вісн. Харк. ун-ту, Біофізичний вісник. - 2001. - № 525. - С. 54-57. (Здобувач провів дослідження змін сумарного вмісту кальцію в ацинарних клітинах під впливом медіаторів, взяв участь в аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні статті.)

3. Федірко Н.В., Вац Ю.О., Клевець М.Ю. Ідентифікація Са²⁺-активованої, Mg²⁺-залежної АТФ-ази мікросомальної фракції мембран секреторних клітин ізольованих ацинусов підщелепної слинної залози щурів. // Вісник Львівського університету. Серія біологічна. - 2002. - Вип. 28. - С. 303-310. (Здобувач провів дослідження, статистичне опрацювання результатів, аналіз експериментальних даних, взяв участь у написанні та оформленні статті.)

4. Вац Ю.А., Федирко Н.В., Клевець М.Ю., Войтенко Н.В. Роль SH-групп в функционировании кальцийтранспортных АТФаз, регулирующих кальциевый гомеостаз и экзоцитоз.// Нейрофизиология // Neurophysiology. - 2002. – Т. 34, № 1. - С. 7-17. (Здобувач провів дослідження та статистичне опрацювання результатів досліджень, взяв участь в аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні статті.)

5. Fedirko N., Vats Ju., Klevets M., Kruglikov I., Voitenko N. Neuronal control of the exocytosis and calcium homeostasis // Neurophysiology. - 2002. - Vol. 34, Nо. 2/3. - P.144-147. (Здобувач провів дослідження, взяв участь в аналізі експериментальних даних, написанні, оформленні та перекладі статті.)

6. Федирко Н.В., Вац Ю.О., Кругликов И.А., Войтенко Н. В. Изменения функционирования Са²⁺-АТФаз экзокринных клеток крыс при экспериментальном диабете. // Нейрофизиология / Neurophysiology. - 2003. - Т. 35, № 5. - 12 с. (Здобувач провів дослідження, взяв участь в аналізі експериментальних даних та написанні статті.)

7. Fedirko N., Klevets M., Vats Yu. Caffeine-induced Changes of Steady-state Ca²⁺ Content in the Secretory Cells of Rat Submandibular Salivary Gland. // XXXIV International Congress of Physiological Sciences, July, 25 – August, 1, 2001, Christchurch, New Zealand. Programme and Abstracts. - http: // iups.esc.auckland.ac.nz/cgi-in/get_registrant.cgi?registrants.id =1996. (Здобувач провів дослідження та аналіз експериментальних даних.)

8. Fedirko N., Vats Ju., Klevets M. Noradrenaline-activated Са²⁺ influx into the secretory cells of submandibular salivary gland // International Symposium “Intracellular Signaling in Plant and Animal Systems (ISPAS)”, 9-14 September, 2001, Kyiv, Ukraine, 2001. Programme and Abstracts of International Symposium. - P. 59. (Здобувач провів дослідження, взяв участь в аналізі експериментальних даних, написанні, оформленні, перекладі тез доповіді та представляв стендову доповідь на конференції.)

9. Fedirko N.V., Kruglikov I.A., Vats Ju.A., Klevets M.Yu. Possible mechanism of steady-state Ca²⁺ increase in the acinar secretory cells of rat submandibular salivary glands // Fourth Conference of the Czech Neuroscience Society, October 23-25, 2001, Prague. - Abstract. - 2001. - P. 68. (Здобувач провів дослідження та статистичне опрацювання результатів досліджень, взяв участь в аналізі експериментальних даних, написанні, оформленні та перекладі тез доповіді.)

10. Vats Ju., Klevets M., Fedirko N. Involvement of SH-groups in the regulation of PMCA and SERCA functional activity // Proceedings of the Physiological Society Meeting, Liverpool, July 8-12, 2002. - J Physiol (Lond). - 2001. - Vol. 543. - P. 66. (Здобувач провів дослідження та статистичне опрацювання результатів досліджень, взяв участь в аналізі експериментальних даних, написанні та перекладі тез доповіді, представляв стендову доповідь на конференції.)

11. Вац Ю.О., Федірко Н.В., Клевець М.Ю. Дослідження Ca²⁺-, Mg²⁺-ATФазних активностей плазматичної та ендоплазматичної мембран секреторних клітин підщелепної слинної залози щурів// 16-й з`їзд українського фізіологічного товариства. 28-30 травня, 2002 р., Вінниця. - Фізіол. журн. - 2002. - Т. 48, № 2. - С.130-131. (Здобувач провів дослідження, взяв участь в аналізі експериментальних даних, написанні тез доповіді та представляв стендову доповідь на конференції.)

12. Федірко Н.В., Вац Ю.О., Пасович О.Б., Копач О.В., Клевець М.Ю. Дослідження механізмів підтримання Са²⁺-гомеостазу в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози щурів.// III з’їзд Українського біофізичного товариства. 8-11 жовтня 2002 р., Львів. Тези доповідей. - С. 68. (Здобувач провів дослідження та статистичне опрацювання результатів досліджень, взяв участь в аналізі експериментальних даних, написанні тез доповіді та представленні стендової доповіді на конференції.)

13. Вац Ю.О., Федірко Н.В., Клевець М.Ю. Залежність функціональної активності Са²⁺-АТФаз мембран секреторних клітин слинних залоз від концентрації АТФ.// Матеріали міжнародної конференції. присвяченої пам’яті професора Шостаковської І.В. 11-12 жовтня 2002 р., Львів, С. 14. (Здобувач провів дослідження та статистичне опрацювання результатів досліджень, взяв участь в аналізі експериментальних даних, написанні тез доповіді та представленні стендової доповіді на конференції.)

14. Fedirko N.V., Vats Ju., Klevets M.Yu. Role of Endoplasmic Ca²⁺-stores in Cholinergic Ca²⁺ Signaling in Rat Salivary Acinar Cells // 47^th Annual Meeting of the Biophysical Society, 2-7 March 2003, San-Antonio, Texas, USA. - Biophysical J. - 2003. - Vol. 84, № 2. - P. 228. (Здобувач провів дослідження та статистичне опрацювання результатів досліджень, взяв участь в аналізі експериментальних даних, написанні, перекладі тез доповіді та представленні стендової доповіді на конференції.)

15. Fedirko N., Vats J., Voitenko N. Effect of streptozotocin-induced diabetes on salivary secretory cells Ca²⁺-ATPase // 3^rd FEPS Congress, 28 June-2 July, 2003, Nice, France. - Abstract book. - P. 16. (Здобувач провів дослідження та статистичне опрацювання результатів досліджень, взяв участь в аналізі експериментальних даних, написанні, оформленні та перекладі тез доповіді.)