Анотація до роботи:

Гринюк І.І. Структурний стан хроматину тимоцитів за дії іонізуючої радіації та пероксиду водню. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук зі спеціальності 03.00.04 – біохімія. – Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2005.

Дисертація присвячена порівняльному дослідженнню дії іонізуючої радіації та пероксиду водню на структурний стан хроматину тимоцитів.

Методом профарбовування тимоцитів флуоресцентними барвниками Хехст 33342 та пропідію йодид виявлено підвищення вмісту клітин з ознаками апоптозу упродовж 3-годинної інкубації після рентгенівського опромінення (4,5 Гр) або додавання 0,1 мМ Н₂О₂. Показано відмінності у характері та динаміці порушень структури хроматину за дії радіації та пероксиду водню. Аналіз параметрів термоденатурації хроматину та електрофоретичного визначення вмісту гістонів показали, що внесок ділянок вільної, дестабілізованої, лінкерної та корової ДНК у сумарний гіперхромізм хроматину опромінених тимоцитів знижується порівняно з контролем та падає вміст гістонів Н2В та Н1. Порушення структури, виявлені при плавленні хроматину тимоцитів, підданих дії Н₂О₂, виявляються переважно на наднуклеосомному рівні, спостерігається специфічне зниження вмісту гістону у субфракції Н1b. Фрагментація ДНК у опромінених тимоцитах більшою мірою пригнічується сперміном та хлороквіном, а у підданих дії Н₂О₂ клітинах - "-токоферолом та циклоспорином А. Через 1 год після дії Н₂О₂, але не іонізуючої радіації, у мітохондріях тимоцитів відбуваються порушення, які зумовлюють їх здатність за умови внесення у безклітинну систему викликати фрагментацію ДНК у ядрах контрольних тимоцитів.

1. Методом прижиттєвого фарбування клітин специфічними до ДНК флуоресцентними барвниками Хехст 33342 та пропідію йодид встановлено, що упродовж 3-годинної інкубації тимоцитів після рентгенівського опромінення у дозі 4,5 Гр або додавання 0,1 мМ Н₂О₂ вміст клітин з морфологічними ознаками апоптозу підвищується (до 36,1% та 31,2% від загального вмісту клітин відповідно). У цей термін вміст низькомолекулярних фрагментів ДНК, екстрагованих з хроматину опромінених та оброблених Н₂О₂ тимоцитів, зростає у 4,2 та 3,1 рази порівняно з контролем відповідно.

2. Динаміка та характер порушення структури хроматину у тимоцитах за дії іонізуючої радіації та Н₂О₂ розрізняються. В опромінених тимоцитах спостерігається рання конденсація хроматину, яка супроводжується його фрагментацією та появою апоптичних тілець, тоді як серед підданих дії Н₂О₂ клітин переважають клітини зі зміщеним у ядрі конденсованим хроматином.

3. Аналіз параметрів термоденатурації хроматину показав, що початкові порушення його структури за дії обох чинників відбуваються у ділянках лінкерної ДНК. В опромінених клітинах дезорганізація хроматину виявляється у зниженні внеску у сумарний гіперхромізм ділянок вільної, дестабілізованої, лінкерної та зв’язаної з гістонами ДНК. Порушення структури хроматину клітин, підданих дії Н₂О₂, виявляються переважно на наднуклеосомному рівні.

4. За інкубації ядер опромінених тимоцитів відбувається зниження вмісту корового гістону Н2В та обох субфракцій гістону Н1, а за інкубації ядер підданих дії Н₂О₂ тимоцитів - зниження вмісту гістону лише у субфракції Н1b.

5. Фрагментація ДНК у опромінених тимоцитах значно пригнічується за присутності у середовищі інкубації 1 мМ сперміну або 20 мкМ хлороквіну, а у підданих дії Н₂О₂ тимоцитах – за присутності 100 мкМ "-токоферолу та 2 мкМ циклоспорину А.

6. Внесення у середовище інкубації мітохондрій іонів Са²⁺ (50 мкМ) та 0,1 мМ Н₂О₂ викликає посилення неселективної проникності мітохондріальної мембрани. Кальцій був ефективнішим у індукції цього процесу та посилював викликане пероксидом водню набухання мітохондрій.

7. Через 1 год після дії Н₂О₂, але не іонізуючої радіації, у мітохондріях тимоцитів відбуваються порушення, які зумовлюють їх здатність викликати фрагментацію ДНК у ядрах контрольних тимоцитів за умови внесення у безклітинну систему.

8. Внесення у безклітинну систему постмітохондріального супернатанту 15000 g, виділеного з тимоцитів через 1 год після додавання Н₂О₂ або через 3 год після опромінення, призводило до посилення фрагментації ДНК у ядрах, що свідчить про залучення позаядерних та позамітохондріальних факторів до порушення структури хроматину та деградації ДНК за дії досліджуваних чинників.

Публікації автора:

1. Солодушко В.О., Гринюк І.І., Борисов С.І., Матишевська О.П. Залежність від кальцію індукованого радіацією ендонуклеолізу хроматину у лімфоїдних клітинах // Вісник Київського університету. Серія: Біологія. - 1998. – Вип. 28. - С. 16-18. (Особистий внесок здобувача – визначення вмісту полідезоксирибонуклеотидів у клітинах).

2. Борисов С.І., Гринюк І.І., Ковальова В.А., Птиця О.М., Матишевська О.П. Отримання та характеристика препарату ядер лімфоцитів тимуса і селезінки щурів // Вісник Київського університету. Серія: Біологія. - 1999. – Вип. 29. - С. 12-14. (Особистий внесок здобувача – виділення лімфоїдних клітин з селезінки і тимусу щурів, отримання ядерної фракції).

3. Дворщенко К.О., Гринюк І.І., Капралов О.О., Матишевська О.П. Інтенсифікація реакцій переокислення у мітохондріях тимоцитів передує фрагментації ДНК за радіаційного апоптозу // Вісник Київського національного університету. Серія: Біологія. - 2002. - Вип. 36. - С. 10-14. (Особистий внесок здобувача – виділення ядерної та мітохондріальної фракцій тимоцитів, статистична обробка та аналіз отриманих даних).

4. Гринюк І.І., Коваль Т.В., Степанська Е.Р., Коноплич Л.О., Капралов О.О. Дослідження вмісту гістонів у ядрах, виділених з тимоцитів на ранніх стадіях радіаційного апоптозу // Вісник Київського національного університету. Серія: Біологія. - 2002. – Вип. 37. - С. 102-106. (Особистий внесок здобувача – виділення ядерної фракції тимоцитів, проведення електрофорезу білків ядер, аналіз електрофореграм).

5. Гринюк І.І., Капралов О.О., Матишевська О.П. Використання безлітинної системи для дослідження участі цитозолю та мітохондрій у індукції апоптозу тимоцитів // Вісник Київського національного університету. Серія: Біологія. - 2003. - Вип. 40. - С. 70-72. (Особистий внесок здобувача – виділеня ядерної, мітохондріальної та грубої розчинної фракції тимоцитів, визначення вмісту полідезоксирибонуклеотидів у ядрах, статистична обробка та аналіз отриманих даних).

6. Гринюк І.І., Чабанний В.М., Матишевська О.П., Кучеренко М.Є. Дослідження структури хроматину у тимоцитах in vitro після дії радіації та пероксиду водню // Фізика живого. – 2003. – Вип. 11. - № 2. – С. 37 – 45. (Особистий внесок здобувача – виділення ядерної фракції, хроматину, електрофорез гістонів, оцінка параметрів термоденатурації хроматину).

7. Гринюк І.І., Корнійчук Г.М, Капралов О.О., Матишевська О.П. Зміни структурного стану хроматину у тимоцитах на ранньому етапі апоптозу за індукції пероксидом водню та радіацією // Український біохімічний журнал. – 2004. - № 5. – С. 90 – 95. (Особистий внесок здобувача – флуоресцентний аналіз тимоцитів, виділення ядерної, мітохондріальної та грубої розчинної фракцій, визначення вмісту полідезоксирибонуклеотидів у клітинах та ядрах, аналіз отриманих даних).

8. Гребинык Д.М., Гринюк И.И., Матышевская О.П. Исследование кальциевого гомеостаза в тимоцитах при апоптозе. II. Аккумуляция Са²⁺ митохондриями и эндоплазматическим ретикулумом // Український біохімічний журнал. – 2005. – Т. 77, № 2. – С. 78 – 81. (Особистий внесок здобувача – визначення вмісту полідезоксирибонуклеотидів у клітинах).

9. Петрова Г.В., Гринюк І.І. Пригнічення D,L-a-токоферолом апоптозу тимоцитів і гепатоцитів, викликаного дією радіації, дексаметазону та перекису водню // Український біохімічний журнал. Спеціальний випуск. Матеріали VIII Українського Біохімічного з’їзду (1-3 жовтня 2002р.). Чернівці, 2002. - Т. 74, № 4а. - С. 70.

10. Гринюк І.І., Степанська Е.Р., Коноплич Л.О., Чабанний В.Н., Капралов О.О. Дослідження структури хроматину та вмісту гістонів у ядрах тимоцитів після дії радіації // Український біохімічний журнал. Спеціальний випуск. Матеріали VIII Українського Біохімічного з’їзду (1-3 жовтня 2002 р.). Чернівці, 2002. - Т. 74, № 4б. - С. 217-218.

11. Дворщенко К.О., Гринюк І.І., Миронюк В.І., Яніш Ю.В., Матишевська О.П. Ранні прояви апоптозу тимоцитів, викликаного іонізуючим випромінюванням у дозі 1 Гр // Тези доповідей III з’їзду Українського біофізичного товариства (8-11 жовтня 2002 р.). – Львів, 2002. – С. 287.

12. Гринюк І.І., Капралов О.О., Матишевська О.П. Використання безклітинної системи для дослідження індукованого радіацією апоптозу тимоцитів // III з’їзд з радіаційних досліджень (радіобіологія і радіоекологія) (21-25 травня 2003 р.). – Київ, 2003. – С. 27.

13. Grynyuk I.I., Kornijchyk A.M., Stepanska E.R. Study on chromatin structure changes in thymocytes induced by ionizing radiation and peroxide in vitro // Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics (September 25-27, 2003). - Kyiv, 2003 – P.66.

14. Grynyuk I., Kapralov O., Matyshevska O. Study on chromatin structure injury at early stages of thymocytes apoptosis induced by peroxide and X-irradiation // First (inaugural) Ukrainian congress for cell biology (April 25 – 28, 2004). - Lviv, 2004. – P. 356.

15. Grebinyk D. M., Koval T. V., Grynyuk I. I., Matyshevska O. P. Oxidative stress and increase in cytosolic Ca²⁺ precedes DNA fragmentation during H₂O₂-induced thymocyte apoptosis // Український біохімічний журнал. Спеціальний випуск. Abstracts of 5-th Parnas conference “Molecular mechanisms of cellular signalling” (April 27-29, 2005). - Kyiv, 2005. - Т. 77, №2.- P. 109.