Анотація до роботи:

Ковальова В. А. Структурно-функціональна характеристика дефензину 1 сосни звичайної (Pinus sylvestris L.): ідентифікація, очистка, клонування гена, біологічна активність. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 – біохімія. Інститут біології тварин УААН, Львів, 2008.

У тканинах проростків сосни звичайної (Pinus sylvestris L.) ідентифіковано білок, подібний до рослинних дефензинів. Розроблено оригінальну схему виділення виявленого білка з використанням іонообмінної хроматографії на фосфоцелюлозі у градієнті концентрації хлориду натрію. Встановлено високу антифунгальну активність очищеного дефензину 1 сосни звичайної (PsDef1) in vitro щодо фітопатогеннних грибів із родів Fusarium, Botrytis, Heterobasidion, Alternaria.

Створено бібліотеку кДНК генів сосни, які експресуються в тканинах семиденних проростків сосни звичайної. Із цієї бібліотеки ізольовано клони, які кодують два дефензини сосни, названі нами PsDef1 та PsDef2. кДНК цих білків депоновано в GenBank під номерами .1 та EF4556167.1. Амінокислотна послідовність PsDef1 містила послідовність пептиду, визначеного мас-спектрометричним аналізом в очищеному дефензині сосни.

Показано структурну і функціональну подібність PsDef1 із рослинними дефензинами першої (морфогенної) групи.

Отримано біологічно активний препарат рекомбінантного PsDef1 та поліклональні антитіла проти нього, що дозволило дослідити експресію PsDef1 у тканинах проростків сосни звичайної на рівні білка.

Показано суттєве зростання рівня експресії PsDef1 у тканинах насіннєвих проростків у період елонгації гіпокотилю Pinus sylvestris L. і за умов біотичного стресу, викликаного дією фітопатогенного гриба Heterobasidion annosum.

Детальним аналізом електронних баз даних EST клонів голонасінних виявлено біля 250 дефензиноподібних послідовностей, які класифіковано у чотири групи згідно гомології їхньої первинної структури.

У результаті виконання дисертаційної роботи виявлено новий рослинний дефензин – дефензин 1 сосни звичайної (PsDef1) і встановлено його амінокислотну послідовність. Показано високу антифунгальну активність очищених препаратів ендогенного і рекомбінантного PsDef1 щодо низки фітопатогенних грибів, що дає підстави розглядати їх як потенційні фунгістатичні препарати. Отримано поліклональні антитіла проти дефензину 1 сосни звичайної, які можуть бути застосовані для подальшого дослідження механізмів антифунгальної дії цього білка та створення тест-систем для визначення стійкості хвойних порід до фітозахворювань.

1. Запропоновано схему виділення дефензину сосни звичайної, яка дозволила отримати електрофоретично гомогенний препарат PsDef1 із проростків цього виду у препаративній кількості.

2. Препарат ендогенного PsDef1 за концентрації <1 мкМ володіє інгібувальною дією щодо широкого спектра фітопатогенних грибів, яка супроводжується морфологічними змінами їхніх гіфів. Не встановлено антибактеріальних властивостей за концентрації препарату <10 мкМ.

3. Створено бібліотеку кДНК генів сосни, які експресуються у тканинах семиденних проростків сосни звичайної. Ця бібліотека характеризується репрезентативним титром первинних фагів (1,2х10⁶ БУО/мл) і високою якістю (1,5 % нерекомбінантних фагів). Секвеновано 25 клонів і подано їхні нуклеотидні послідовності до dbEST GenBank під номерами EG418144-51 та EL342377-933.

4. Із отриманої кДНК бібліотеки ампліфіковано дві нуклеотидні послідовності довжиною 252 п.н. із ідентичністю 87 %. Вони кодують структуру двох дефензинів сосни PsDef1 і PsDef2. кДНК цих білків депоновано в GenBank під номерами .1 та EF455617.1.

5. Встановлено структурну і функціональну подібність дефензину 1 сосни звичайної до представників І-ої (морфогенної) групи рослинних дефензинів.

6. У бактеріальній системі E. coli індуковано експресію PsDef1, злитого з глутатіон-S-трансферазою. Встановлено, що оптимальними умовами для продукування рекомбінантного білка у розчинній формі є культивування протягом 2 год при 37 С за концентрації 0,4 мМ ІРТГ. Після афінної очистки на глутатіон-сефарозі та протеолітичного відщеплення GST отримано біологічно-активний препарат рекомбінантного PsDef1, антифунгальна активність якого співмірна з активністю ендогенного дефензину.

7. Отримано та охарактеризовано поліклональні анти-PsDef1 антитіла, які специфічно розпізнають ендогенний і рекомбінантний PsDef1 у Вестерн-блот та імуноензимному аналізах.

8. Показано суттєве зростання рівня експресії PsDef1 у тканинах насіннєвих проростків у період елонгації гіпокотилю Pinus sylvestris L. і за умов біотичного стресу, викликаного дією фітопатогенного гриба Heterobasidion annosum.

9. Аналіз електронних баз даних EST клонів голонасінних дозволив виявити біля 250 дефензиноподібних послідовностей, які класифіковано у чотири групи згідно гомології їх первинної структури.

Публікації автора:

1. Гут Р. Т. Дефензини як фактор резистентності рослин до біотичного стресу / Р. Т. Гут, В. А. Ковальова // Наук. вісник УкрДЛТУ: Зб. наук-техн. праць: Стан і тенденції розвитку лісівничої освіти, науки та лісового господарства в Україні. — Львів: УкрДЛТУ. — 2004. — Вип. 14.6. — C. 49—55. (Автором зроблено узагальнення даних літератури, підготовлено статтю до друку).

2. Ковальова В. А. Новий метод виділення білка з протигрибковою активністю з проростків насіння сосни звичайної / В. А. Ковальова, Р. Т. Гут // Наук. вісник НЛТУ України: Зб. наук-техн. праць. — Львів: НЛТУ України.— 2005. — Вип. 15.4. — C. 30—34. (Автором розроблено методику виділення низькомолекулярних цистеїн-вмісних білків, підготовлено статтю до друку).

3. Kовальова В. А. Характеристика двох дефензиноподібних білків з проростків сосни звичайної / В. А. Ковальова, І. Т. Гут, Р. Т. Гут // Біополімери і клітина. — 2006. — T. 22, № 2. — C. 126—131. (Автором досліджено антимікробну активність очищених дефензиноподібних білків, підготовлено статтю до друку).

4. Ковальова В. А. Виділення білків із фунгіцидною активністю з проростків сосни звичайної / В. А. Ковальова, Р. Т. Гут // Физиология и биохимия культурных растений. — 2007. — T. 39, № 2. — C. 114—120. (Автором виділено білки з фунгіцидною активністю, підготовлено статтю до друку).

5. Ковальова В. А. Kлонування та аналіз кДНК дефензину 1 сосни звичайної / В. А. Ковальова, І. Т. Гут, Р. Г. Киямова, В. В. Філоненко, Р. Т. Гут // Біополімери і клітина. — 2007. — T. 23, № 5. — C. 398—404. (Автором проведено клонування повнорозмірної форми дефензину 1 сосни звичайної, проведено аналіз його амінокислотної послідовності, підготовлено статтю до друку).

6. Ковальова В. А. Створення та аналіз бібліотеки генів сосни звичайної / В. А. Ковальова, Р. Т. Гут // Наук. вісник НЛТУ України: Зб. наук-техн. праць. — Львів: НЛТУ України. — 2007. — Вип. 17.3. — С. 65—69. (За участі автора створено кДНК бібліотеку сосни звичайної, автором виділено м-РНК, проаналізовано кДНК бібліотеку, підготовлено статтю до друку).

7. Ковальова В. А. Аналіз експресії дефензину в процесі проростання насіння сосни звичайної / В. А. Ковальова, Г. Т. Криницький, Р. Т. Гут // Наук. вісник НЛТУ України: Зб. наук-техн. праць. — Львів: НЛТУ України. — 2007. — Вип. 17.8. — С. 24—27. (За участі автора отримано поліклональні антитіла, визначено рівень експресії дефензину 1 у тканинах проростків, підготовлено статтю до друку).

8. Kovalyova V. The analysis of tyrosine phosphorylation in the process of seed germination of Scots pine / V. Kovalyova, R. Cramer, I. Gout, R. Gout // Molecular mechanisms of cellular signaling : 5^rd Parnas Conf., April 26-29, 2005. : Український біохімічний журнал. — 2005. — T. 77, № 2 (спец. вип.). — С. 119—120.

9. Гут Р. Т. Новий метод виділення білків з протигрибковою ативністю з проростків насіння сосни звичайної / Р. Т. Гут, В. А. Ковальова // Наукові основи підвищення продуктивності та біологічної стійкості лісових та урбанізованих екосистем : 55-наук.-техн. конф. ЛГФ НЛТУ України, 19-21 трав. 2005р. : тези доп. — Львів, 2005. — С. 19—20.

10. Ковальова В. А. Виділення та характеристика дефензину з проростків сосни (Pinus sylvestris L.) / В. А. Ковальова, Р. Т. Гут // Фітопатогенні бактерії. Фітонцидологія. Алелопатія : міжнар. конф., 4-6 жовт. 2005р. : тези доп. — К., 2005. — C. 97.

11. Ковальова В. А. Антифунгальні властивості дефензину Pinus sylvestris L./ В. А. Ковальова, Р. Т. Гут // Лісівництво України в контексті світових тенденцій розвитку лісового господарства : міжнар. наук.-практ. конф., 20-23 вер. 2006 р. : тези доп. — Львів, 2006. — С. 272273.

12. Kovaleva V. Isolation and the antifungal activity of defensin-like protein from Scots pine roots / V. Kovaleva, R. Gout // Population genetics and genomics of forest trees : from gene function to evolutionary dynamics and conservation : joint conf. UIFRO, October 1-6, 2006 : — Abstract book. — Madrid, 2006. — P. 188—189.

13. Ковальова В. А. Очистка та характеристика дефензину з коренів Pinus sylvestris L. / В. А. Ковальова, І. Т. Гут, Р. Т. Гут // ІХ Укр. біохім. з’їзд, 24-27 жовт. 2006 р. : тези доп. — Х., 2006. — С. 4546.

14. Kovalyova V. Molecular cloning and characterization of the Scots pine defensin / V. Kovalyova, G. Krynytskyy, I. Gout, R. Gout // Онтогенез рослин у природному та трансформованому середовищі. Фізіолого-біохімічні та екологічні аспекти : III міжнар. наук. конф., 4-6 жовт., 2007 р. : тези доп. — Львів, 2007. — С. 194.

15. Kovalуоva V. Investigation of antifungal activity of recombinant defensin 1 from Scots pine / V. Kovalyova, I. Gout, R. Gout // II З’їзд Укр. товар. клітин. біол., 2326 жовт. 2007 р. : тези доп. — К., 2007. — С. 246.