Анотація до роботи:

Авілов С.В. Структурні характеристики та шаперон-подібна функція a-кристаліну кришталика ока. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 – біохімія. – Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України. Київ, 2004.

Дисертацію присвячено вивченню структурних характеристик a-кристаліну, які є важливими для його шаперон-подібної активності.

За допомогою селективно введених в молекулу a-кристаліну двохвильових флюоресцентних зондів виявлено, що за підвищеної температури (в інтервалі до 60^ОС, у якому спостерігається збільшення шаперон-подібної активності), зростає полярність та динамічність оточення залишка цистеїну в С-кінцевому домені А-субодиниці a-кристаліну, а також порушується система водневих зв’язків у вказаному домені.

Показано, що підвищений гідростатичний тиск в інтервалі до 340 МПа спричиняє збільшення шаперон-подібної активності a-кристаліну. Таке збільшення активності супроводжується змінами третинної і четвертинної, але не вторинної структури цього білка. Зокрема, структура білка стає більш динамічною, збільшується полярність оточення залишків трипотофану, зростає площа експонованих гідрофобних ділянок зарахунок часткової дисоціації олігомерів a-кристаліну та змін конформації його субодиниць.

За допомогою підходу, який передбачає імобілізацію a-кристаліну на поверхні сенсорного чіпа спектрометра поверхневого плазмонного резонансу, продемонстровано, що за умов середовища, близьких до нативних, окремим субодиницям a-кристаліну, на відміну від його олігомерів, не притаманна шаперон-подібна активність.

1. Динамічний і полідисперсний характер олігомерів a-кристаліну, а також відсутність даних рентгеноструктурного аналізу для цього білка ускладнюють дослідження його структури, внаслідок чого досі залишається нез’ясованою просторова організація a-кристаліну та його структурні характеристики, які є важливими для шаперон-подібної функції. Розв’язання цієї проблеми вимагає нових методичних підходів, які раніше не використовували для вивчення цього білка.

2. За допомогою двохвильових флюоресцентних зондів, ковалентно приєднаних до єдиного залишка цистеїну в a-кристаліні, виявлено, що за умов теплового стресу, який індукує підвищення шаперон-подібної активності цього білка, відбувається зменшення розмірів олігомерів a-кристаліну, зростає полярність оточення С-кінцевого домена його А-субодиниці та порушується система водневих зв’язків у цьому домені.

3. Показано, що підвищений гідростатичний тиск в інтервалі 200-340 мегапаскалів спричиняє збільшення шаперон-подібної активності a-кристаліну.

4. Збільшення шаперон-подібної активності a-кристаліну, спричинене дією підвищеного гідростатичного тиску, супроводжується змінами його третинної і четвертинної, але не вторинної структури. Зокрема, збільшується площа експонованих гідрофобних ділянок за рахунок часткової дисоціації олігомерів a-кристаліну та змін конформації його субодиниць, структура стає більш динамічною, зростає проникнення молекул води всередину білкової глобули.

5. За допомогою методу поверхневого плазмонного резонансу продемонстровано, що за умов середовища, близьких до нативних, окремі субодиниці a-кристаліну, на відміну від олігомерів, не здатні зв'язувати денатуровані білки, тобто їм не притаманна шаперон-подібна активність.

Публікації автора:

1. Авілов С.В., Веревка С.В., Чегель В.І., Ширшов Ю.М., Демченко О.П. Порівняльне дослідження імобілізації пероксидази хріну на модифікованій поверхні золота методом поверхневого плазмонного резонансу // Укр. Біохім. Журн. – 2001. – Т. 73, № 2. – С. 44-50.

2. Bode Cs., Tolgyesi F.G., Smeller L., Heremans K., Avilov S.V., Fidy J. Chaperone-like Activity of a-Crystallin is Enhanced by High Hydrostatic Pressure Treatment // Biochem. J. – 2003. – V. 370. – P. 859-866.

3. Avilov S.V., Aleksandrova N.A., Demchenko A.P. Quaternary Structure of a-Crystallin is Necessary for the Binding of Unfolded Proteins. A Surface Plasmon Resonance Study // Protein and Peptide Letters. – 2004. – V. 11, № 1. – P. 41-48.

4. Klymchenko A.S., Avilov S.V., Demchenko A.P. Resolution of Cys and Lys labeling of alpha-crystallin with site-sensitive fluorescent 3-hydroxyflavone dye // Analytical Biochemistry. – 2004. – V. 329, № 1. – P. 43-57.

5. Авілов С.В., Александрова Н.О., Кунда Є.М., Веревка С.В., Ширшов Ю.М. Застосування соєвого інгібітора трипсину для модифікації поверхні золота сенсорних чіпів спектрометра поверхневого плазмонного резонансу // Укр. Біохім. Журн. – 2004. – Т. 76, № 3. – С. 98-103.

6. Avilov S.V., Verevka S.V., Chegel V.I., Demchenko A.P., Shirshov Yu.M. A Surface Plasmon Resonance-Based Approach to Investigate Molecular Chaperone-Folding Substrate Interaction // III International Conference on Molecular Recognition. – Pecs, Hungary, 2000. – P. 62.

7. Авілов С.В., Боде Ч., Толдьоші Ф., Демченко О.П. Вплив гідростатичного тиску на четвертинну структуру та шаперонову функцію a-кристаліну // Конференція-конкурс робіт молодих вчених „Актуальні проблеми біохімії та біотехнології”. – Київ, 2001. – Укр. Біохім. Журн. – 2002. – Т. 74, № 1. – С. 134.

8. Авилов С.В., Демченко А.П. Исследования методом поверхностного плазмонного резонанса указывают, что изолированные субъединицы a-кристаллина не способны связывать развернутые белки // 7-я Пущинская школа-семинар молодых ученых “Биология – наука 21-го века”. – Пущино, Россия, 2002. – C. 206.

9. Avilov S.V., Zaletok S.P., Shirshov Yu.M. Golg surface modification by soybean trypsin inhibitor for surface plasmon resonance technique // 8-й Український біохімічний з’їзд. – Чернівці, 2002. – Укр. Біохім. Журн. – 2002. – Т. 74, № 4б (додаток 2). – С. 19.

10. Avilov S.V., Demchenko A.P. Is quaternary structure of a-crystallin needed for interaction with an unfolded protein? // 28^th Meeting of FEBS. – Istanbul, Turkey, 2002. – P. 63-64.

11. Klymchenko A.S., Avilov S.V., Demchenko A.P. Multiparametric probing of microenvironment in model and biological systems with two-band fluorescence dyes and labels // 47^th Annual Meeting of the Biophysical society. – San Antonio, USA, 2003. – № 1399.

12. Авілов С.В., Боде Ч., Толдьоші Ф., Демченко О.П. Структурні особливості та шаперон-подібна функція -кристаліну кришталика ока // Конференція-конкурс робіт молодих вчених „Актуальні проблеми біохімії та біотехнології”. – Київ, 2003. – С. 6.

13. Avilov S.V., Bode Cs., Tolgyesi F., Fidy J., Klymchenko A., Demchenko A. Heat perturbation of a-crystallin structure studied by a novel SH-reactive ratiometric fluorescence probe // Joint Euresco conference/FEBS Advanced Course “Biology of Molecular Chaperones”. – Tomar, Portugal, 2003. – № 3.

14. Klymchenko A.S., Avilov S.V., Ercelen S., Demchenko A.P. Application of Two-Color Ratiometric Site-Selective Fluorescence Probes and Labels in Protein Research // 48^th Annual Meeting of the Biophysical society. – Baltimore, USA, 2004. – P. 606a.