Анотація до роботи:

Мірошниченко Д.О. Структура і функції ГТФаз- модулюючих ділянок білка Bcr при Ph’-позитивних лейкеміях. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.03 –молекулярна біологія. – Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, Київ, 2008.

Метою даної роботи було дослідження особливостей структури DH і РН доменів білка Bcr та встановлення їхньої функціональної активності. Для цього були клоновані ділянки гена bcr, що відповідають DH і PH доменам, а також тандему DHPH білка Bcr та отримані рекомбінантні білки DH, РН і DHPH. Вперше було проведено дослідження GEF- активності DH домену Bcr окремо і разом з РН доменом методом “pull down”-аналізу. Показано, що відсутня його GEF- активність щодо Rho-ГТФаз підкласів RhoA, Cdc42 і Rac1 in vitro та in vivo. Визначені ліпіди, що зв‘язуються з РН доменом Bcr із високою афінністю. Методами ”pull down”, двовимірного електрофорезу і мас-спектрометрії вперше показано взаємодію РН домену Bcr з білками, підтверджено зв‘язування з білками SMC1, -тубулін, зизимін1, PLC. Показано вплив РН домену на субклітинну локалізацію білка Bcr-Abl.

Вивчено структурно-функціональну роль DH і РН доменів у складі білків Bcr та р210 Bcr-Abl. Результати проведених досліджень розширюють уявлення про сигнальні шляхи білків р210 і р230 Bcr-Abl, до складу яких вони входять, дають можливість пояснити вплив різних форм гібридного білка Bcr-Abl на диференціювання гемопоетичних стовбурових клітин та перебіг Ph’- позитивних лейкемій.

1. Клоновано DH, РН і DHPH ділянки гена bcr у вектори для бактеріальної експресії та експресії у клітинах евкаріотів, отримано відповідні рекомбінантні білки. Дані кругового дихроїзму свідчать на користь близької до нативної структури рекомбінантного РН домену Bcr.

2. Визначено специфічність зв‘язування РН домену Bcr із ліпідами методом ліпід-білкової гібридизації. Показано, що РН домен Bcr зв‘язує фосфатидилінозитоли РІ(3)Р, РІ(4)Р і РІ(5)Р із високою афінністю.

3. Із використанням методів двовимірного електрофорезу і MALDI TOF мас-спектрометрії ідентифіковано 23 білки, що зв‘язують РН домен. Підтверджено взаємодію PH домену Bcr із білками SMC1, -тубулін, зизимін1, PLC in vitro та in vivo.

4. Показано відсутність GEF-активності ізольованого DH домену Bcr щодо Rho-ГТФаз підкласів RhoA, Cdc42 і Rac1 in vitro та in vivo. Встановлено, що наявність РН домену не впливає на функціональну активність домену DH.

5. Показано вплив РН домену на характер субклітинної локалізації різних форм білка Bcr-Abl.

Публікації автора:

1. Мірошниченко Д., Малюта О., Ложко Д., Телегеєв Г., Малюта С. Аналіз первинної і вторинної структури РН домену білка Bcr // Доповіді Національної Академії Наук України. -2007. –№7. –С.176-180. Дисертантом клоновано фрагмент кДНК, що відповідає РН домену білка Bcr. В мінімальному середовищі експресовано та очищено рекомбінантний білок РН. Проаналізовано КД спектри рекомбінантного білка та вторинну структуру РН домену Bcr.

2. Мірошниченко Д.О., Дубровська А.М., Телегеєв Г.Д., Малюта С.С. Визначення специфічності білок-ліпідних і білок-білкових взаємодій РН домену білка Bcr, пов‘язаного з хронічною мієлоїдною лейкемією // Біополімери і клітина. –2007. –Т.23, №5. –С.405-409. Дисертантом експресовано і очищено рекомбінантний білок, що містить РН домен Bcr. Досліджено специфічність зв‘язування РН домену з ліпідами і білками, проаналізовано вплив РН домену на локалізацію білка, до складу якого він входить.

3. Мірошниченко Д.О., Телегеєв Г.Д., Малюта С.С. Аналіз GEF- активності DH домену білка Bcr // Український біохімічний журнал. –2007. –Т.79, №5. –С.55-60. Дисертантом отримано конструкції, що експресують DH і DHPH домени Bcr, перевірено GEF-активність DH домену в експериментах in vivo.

4. Малюта С.С., Дибков М.В., Телегеєв Г.Д., Мірошниченко Д.О. Спосіб діагностики Ph’лейкемій за допомогою специфічних праймерів /Деклараційний патент на корисну модель UA № 10385./ 15.11.2005 бюл. №11. Дисертантом проведено ЗТ-ПЛР із набором специфічних праймерів для модифікованої тест-системи, для діагностики Ph’-хромосоми і виявлення змін в bcr-ділянці химерного гена.

5. Мирошниченко Д.А., Телегеев Г.Д.,Корнелюк А.И. Моделирование пространственной структуры Dbl и РН доменов белка Bcr-Abl // Тезисы 7й Пущинской школы-конференции молодых учених. –Пущино (Россия) -2003 г. -С.354. Дисертантом проаналізовано первинну структуру DH і РН доменів, модульовано просторову структуру DHPH фрагмента білка Bcr.

6. Miroshnychenko D.A., Telegeev G.D., Maliuta S.S. GEF activity analysis of bcr Dbl-homology domain / Abstr. Conference of Young Scientists dedicated to the 185^th anniversary of Gregor Mendel // Біополімери і клітина. –2007. –Т.23, №4. –С.293. Дисертантом проаналізовано GEF-активність DH домену Bcr in vitro та in vivo. Проведено експресію і очищення рекомбінантних білків, проведено трансфекцію клітин евкаріотів, виконано “pull down” аналіз.

7. Телегеєв Г.Д., Дибков М.В., Дубровська А.М., Мірошниченко Д.О., Малюта С.С. Отримання поліклональних антитіл до різних ділянок гібридних білків при Ph-лейкеміях і їх використання для діагностики і вивчення патогенезу хвороби // Тези Установчого з‘їзду Українського товариства клітинної біології. –Львів (Україна). -2004. -С.123. Дисертантом виконано клонування DH і DHPH доменів білка Bcr.

8. Miroshnychenko D., Dybkov M.,Telegeev G., Maliuta S. Lipid binding specificity of Bcr PH domain // Матеріали IX Українського біохімічного з‘їзду. –Харків (Україна). -2006 р. -С.14. Дисертантом клоновано РН фрагмент білка Bcr, проведено аналіз специфічності зв‘язування ліпідів і вплив РН домену на локалізацію білка Bcr-Abl.

9. Miroshnychenko D., Telegeev G., Maliuta S.. Structural and functional peculiarities of Bcr PH domain / Abstr. 6^th Parnas Conference Molecular Mechanisms of Cellular Signalling (30 May- 2 June, 2007, Krakow, Poland) // Acta Biochimica Polonica. –2007. –Vol.54/Sup2. –P.23. Дисертантом проведено аналіз первинної і вторинної структури РН домену Bcr, виявлено мотив, що відповідає за зв‘язування РН доменів з продуктами РІ3- кінази.

10. Мірошниченко Д.О. Аналіз взаємодії РН домену Bcr з білками методами мас-спектрометрії / Конференція молодих учених “Актуальні проблеми біохімії та біотехнології -2007” (червень, 2007р., Київ) // Український біохімічний журнал. –2007. –Т.79, №.4. –С.128. Дисертантом проаналізований спектр білків, які зв‘язуються з РН доменом Bcr.

11. Malyuta O., Miroshnychenko D., Telegeev G. Structure of Bcr PH domain // Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics. Abstract book. –Kyiv (Ukraine). -2007. –P.76. Дисертантом отримано конструкції для експресії полігістидин-зв‘язаного рекомбінантного білка, що містить РН домен Bcr, проаналізовано вміст основних типів вторинної структури.

12. Miroshnychenko D., Dubrovska A., Maliuta S., Telegeev G. Novel view on Bcr PH domain as a protein binding partner / Abstr. ECCO14 the European Cancer Conference // EJC. –2007. –Vol.5, №.4. –P.85. Дисертантом продемонстровано ефективність застосування методів протеоміки для виявлення білків, що зв‘язуються з РН доменом Bcr.