Анотація до роботи:

Семенов Ю.В. Спектральні характеристики індо-1 при зв‘язуванні Са²⁺ в клітині і білкових розчинах. — Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.02. — біофізика. — Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2002.

Дисертація присвячена вивченню спектральних характеристик флуоресцентного кальційчутливого зонда індо-1 в клітині і білкових розчинах та дослідженню впливу температури і гіперкалієвого розчину на концентрацію вільного кальцію [Ca²⁺]_i в тимоцитах щура. В тимоцитах визначена “ефективна” концентрація білків, які зв‘язують індо-1. У модельних дослідженнях методом спектрального розкладання досліджено вплив білкового мікрооточення і змін температури на спектральні і кальційзв‘язуючі характеристики індо-1. Встановлено, що константа дисоціації комплексу індо-1 — Са²⁺ зменшується більш ніж в 2 рази зі зростанням температури від 15 до 37 С. З температурної залежності знайдено ентальпію DН=25.96кДж/моль зв‘язування Са²⁺ з індо-1 та показано, що за наявності білку, який зв‘язує індо-1, DН не змінюється. Показано, що в комплексі індо-1 — сироватковий альбумін відбувається передача енергії електронного збудження від триптофанілів білку (донори енергії) до індо-1 (акцептор енергії) за індуктивно резонансним механізмом. Показано, що в тимоцитах передача енергії електронного збудження відбувається в комплексах індо-1 — цитозольні білки. Ефективність передачі, як в розчинах сироваткових альбумінів, так і в тимоцитах, зменшується при зростанні концентрації Са²⁺. Вивчено зміну спектральних внесків (a, b, g) трьох форм індо-1 (кальційвільної L, кальційзв‘язаної LM і білокзв‘язаної LP) в інтегральних спектрах флуоресценції індо-1 в розчинах сироваткових альбумінів і тимоцитах щурів при різних температурах. Показано, що спектр LP-форми в клітинах добре моделюється спектром LP-форми індо-1, який зв‘язується з САЛ. Методом спектрального розкладання інтегральних спектрів індо-1 досліджено зміни [Ca²⁺]_i в тимоцитах при різних температурах та при дії гіперкалієвого розчину.

1. У модельних експериментах методом спектрального розкладання досліджено вплив білкового мікрооточення і змін температури на спектральні і кальційзв‘язуючі характеристики флуоресцентного зонда індо-1. Вивчено зміну спектральних внесків (a, b, g) трьох форм (кальційвільної L, кальційзв‘язаної LM та білокзв‘язаної LP) в інтегральних спектрах флуоресценції індо-1 в розчинах сироваткових альбумінів і тимоцитах при різних температурах. Методом спектрального розкладання інтегральних спектрів індо-1 і вилученням з них некальцієвої LP-форми досліджено внутрішньоклітинний вільний кальцій [Ca²⁺]_i в тимоцитах при різних температурах та зміни [Ca²⁺]_i в тимоцитах при дії гіперкалієвого розчину.

2. На оброблених дігітоніном (5мкМ) мембранопроникних тимоцитах отримана ефективна концентрація [P]_i цитозольних білків ([P]_i=0.88±15 мкМ), які зв‘язують індо-1, в результаті чого утворюється характерна за спектром некальцієва LP-форма індо-1.

3. Встановлено, що константа дисоціації комплексу індо-1 — Са²⁺ зменшується більше ніж в 2 рази зі зростанням температури від 15 до 37 С (273 нМ при 15 С і 129 нМ при 37 С). З температурної залежності отримана величина зміни ентальпії DН=25.96 кДж/моль при зв‘язуванні Са²⁺ з індо-1. За наявності в розчині сироваткового альбуміну бика (САБ) уявна збільшується в 1.4 рази (при 22 С =210 нМ у відсутності САБ і 292 нМ за наявності САБ, 7 мкМ), але не змінюється DН.

4. Показано, що індо-1 зв‘язується з сироватковими альбумінами завдяки гідрофобним взаємодіям і відбувається передача енергії електронного збудження від триптофанілів білку до зв‘язаного індо-1. Знайдена з спектрів збудження ефективність E передачі енергії від триптофанілів (донори енергії) до індо-1 (акцептор енергії) становила для комплексу САБ — індо-1 Е=0.12 і для комплексу САЛ — індо-1 Е=0.16. За теорією резонансної диполь-дипольної передачі енергії в комплексі САЛ — індо-1 оцінена ефективна відстань r=4 нм між донором енергії (Trp214) і зв‘язаним індо-1. Передача енергії електронного збудження виявлена при зв‘язуванні індо-1 з цитозольними білками тимоцитів.

5. Методом спектрального розкладання проведена оцінка спектральних внесків (a, b, g) трьох форм (L, LM i LP) в інтегральних спектрах флуоресценції індо-1 в розчинах САБ при 15, 22, 29 і 37 С. Показано, що за незмінного внеску LP-форми (g=0.275±0.022) при зростанні температури від 15 до 37 С зменшується внесок a L-форми і збільшується внесок b LM-форми. Метод спектрального розкладання дозволив коректно вилучати з інтегрального спектру LP-форму і за співвідношенням спектральних внесків L- та LM-форм та отриманим двохвильовим параметром R більш точно кількісно оцінювати концентрацію вільного кальцію [Ca²⁺]_i.

6. Методом спектрального розкладання встановлено, що в тимоцитах реєструється спектр флуоресценції LP-форми з l_max=443-445 нм, який добре моделюється спектром флуоресценції LP-форми індо-1 в розчині САЛ. Вилучення спектру LP-форми з інтегрального спектру індо-1 в тимоцитах дозволило отримати при 22 С базальний рівень цитозольного [Ca²⁺]_i в нормальному розчині Кребса ([Ca²⁺]_i=140±10 нМ) і у відсутності іонів Са²⁺ в позаклітинному розчині ([Ca²⁺]_i=70±13 нМ).

7. Встановлено, що зростання температури від 15 до 37 С приводить до незначного закислення (@0.1 одиниць рН) цитозолю тимоцитів і до помітного зниження в 1.55 рази базального рівня [Ca²⁺]_i (при 15 С [Ca²⁺]_i=179±12 нМ і при 37 С [Ca²⁺]_i=115±10 нМ. Такі температурні зміни [Ca²⁺]_i, можливо пов‘язані з більш ефективною роботою Са²⁺-помп і Na⁺-Ca²⁺-обмінника мембранних структур при 37 С.

8. Показано, що в гіперкалієвому розчині (100 мМ KCl) спостерігаються Са²⁺-сигнали, які за формою мають фазу швидкого збільшення [Ca²⁺]_i на 60±5 нМ від базального рівня і повільне (за 15 хв) зменшення [Ca²⁺]_i до базального рівня.

Список опублікованих за темою дисертації робіт

1. Зима В. Л., Семенов Ю. В., Дячок О. М., Ганчурін В. В. Флуоресцентні характеристики індо-1 при взаємодії з сироватковими альбумінами // Фізика живого. — 1998. — 6, № 2. — С. 30-39.

2. Ветров О. П.,. Дячок О. М, Зима В. Л. Ляховецький Р. В., Мельничук І. В., Семенов Ю.В. Метод коригування спектрів флуоресценції Са²⁺-чутливих зондів // Вісник Київського університету імені Тараса Шевченка. Біологія. — 1998. — Вип. 28. — С. 7-10.

3. Зима В.Л., Семенов Ю.В. Влияние температуры на флуоресцентные характеристики индо-1 при взаимодействии с сывороточными альбуминами и ионами кальция // Фізика живого. — 1999. — 7, № 1. — С. 48-53.

4. Зима В. Л., Мірошниченко М. С., Чумаков С. П., Семенов Ю. В., Биць О. В. Автоматизований мікроспектрофлуориметр для вимірювання флуоресцентних характеристик біооб‘єктів // Вісник Київського університету імені Тараса Шевченка. Біологія. — 2000, — Вип. 31. — С. 6-8.

5. Семенов Ю. В., Ганчурін В.В., Залоїло І.А. Вплив температури на флуоресцентні і кальційзв‘язуючі характеристики індо-1 Вісник Київського університету імені Тараса Шевченка. Біологія. — 1999, — Вип. 29. — С. 11-12.

6. Семенов Ю. В., Зима В. Л., Артеменко О. Ю., Ганчурін В. В. Дослідження методом спектрального розкладання флуоресценції індо-1 в білкових розчинах і тимоцитах // Фізика живого. — 2001. — Т. 9, № 1. — С. 35-44.

7. Зима В. Л., Дячок О. М., Семенов Ю. В. Флуоресцентні і кальцій-зв‘язуючі характеристики індо-1 при взаємодії з білками // ІІ з‘їзд українського біофізичного товариства — 1998., 29 червня 3 липня, Харків, Україна.

8. Zyma V. L., Semenov Yu. V. Fluorescence energy transfer in indo-1 — serum albumin complex // XIV International School-Seminar “Spectroscopy of molecules and crystals” — 1999., 7-12 June, Odessa, Ukraine.

9. Семенов Ю. В., Зима В. Л. Кальцієва сигналізація: реєстрація і кількісна оцінка // V Міжнародна конференція “Інформотерапія теоретичні аспекти і практичне застосування” — 1999, 14-18 грудня, Київ, Україна.

10. Zyma V. L., Semenov Yu. V., Miroshnichenko M. S. Fluorescence indo-1 in the thymocytes and at binding with serum albumin // International Conference “Physics of liquid matter: modern problems”. — 2001. — 14-19 September, Kyiv, Ukraine.

11. Zyma V. L., Semenov Yu. V., Miroshnychenko M. S., Prylutskyy Yu. I. Temperature effect on the fluorescent properties of Ca²⁺ — indo-1 complex // International Workshop “Physical aspects of the luminescence of complex oxide dielectrics”. — 2001. — 24-26 September, Kyiv, Ukraine.

12. Зима В. Л., Семенов Ю. В., Артеменко О. Ю., Ганчурін В. В. Кальційзв‘язуючі та флуоресцентні характеристики індо-1 у клітині. // Тези доповідей всеукраїнської наукової конференції “Актуальні проблеми гастроентерології”. – 2001. – 2-21 грудня, Київ – С.20.