Анотація до роботи:

Лукаш Т.О. Шапероноподібні властивості компонентів апарату трансляції вищих еукаріотів. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.03 – молекулярна біологія. – Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, Київ, 2006.

В роботі подано експериментальні докази шапероноподібних властивостей 80S рибосом та eEF1A. Здатність 80S рибосом відновлювати активність частково інактивованих LeuRS, IleRS і PheRS та попереджати термоінактивацію PheRS при 42 С свідчить про ренатуруючі і стабілізуючі властивості рибосом. eEF1A відновлює активність термоінактивованих PheRS і SerRS і стабілізує активність PheRS за умов термоінактивації. Структурні зміни молекул PheRS, визначені методами кругового дихроїзму, динамічного світлорозсіяння і електрофорезу в агарозі в нативних умовах полягають у зміні загального поверхневого заряду молекул, 20 % зменшенні вмісту - спіральних структур і формуванні агрегатів молекул PheRS. Показано, що eEF1A відновлює загальний поверхневий заряд молекул PheRS і зменшує рівень агрегації подібно до молекулярних шаперонів.

Шапероноподібні властивості 80S рибосом і eEF1A можуть мати особливе значення в клітинах вищих еукаріотів з високим рівнем компартменталізації. 80S рибосоми і еЕF1А можуть забезпечувати підтримку функціонально активної конформації компонентів білоксинтезувального апарату.

У роботі вперше показано, що рибосоми і eEF1А ссавців мають подібну до молекулярних шаперонів здатність стабілізувати і відновлювати функціонально активну форму ARS та запропоновано механізм шапероноподібної дії eEF1А. Така властивість компонентів апарату трансляції може бути важливою для підтримки активної конформації ARS в трансляційних компартментах протягом послідовних циклів елонгації.

1. Виявлено вплив 80S рибосом на каталітичну активність „вільної” PheRS та LeuRS і IleRS, що входять до складу мультиферментного комплексу ARS, причому максимальний рівень стимуляції спостерігали для ферментних препаратів із низькою активністю. Додавання 80S рибосом або 60S субчастинок рибосом призводило до зростання значень k_cat і співвідношення К_М/k_cat в 2 рази для LeuRS і IleRS, що свідчить про підвищення ефективності реакції аміноацилювання в присутності рибосом.

2. Показано на прикладі PheRS, що 80S рибосоми здатні стабілізувати ферментативну активність під час термоінактивації при 42 С або відновлювати активність термоінактивованої PheRS з 30 % до 70 % від вихідної активності.

3. Виявлено стимулюючу дію eEF1A на каталітичну активність термоінактивованої PheRS. Показано, що значення k_cat збільшується в два рази порівняно з таким коефіцієнтом для інактивованого ферменту (з 10,38 ± 0,02 хв^–1 до 21,85 ± 0,05 хв^–1).

4. Виявлено стабілізуючий та ренатуруючий ефекти фактора eEF1А при термоінактивації PheRS і SerRS:

інкубація PheRS і SerRS при 42 С 10 хв призводить до зниження каталітичної активності ферментів в 2 – 3 рази, а подальша інкубація з eEF1A відновлює їхню ферментативну активність до 70% від активності нативного ферменту зі збільшенням k_cat для PheRS в два рази порівняно з цим параметром для інактивованого ферменту;

у присутності eEF1A активність PheRS за умов термоінактивації повністю зберігається.

5. Методами кругового дихроїзму, динамічного світлорозсіяння та електрофорезу в агарозному гелі в нативних умовах досліджено структурні зміни в молекулах PheRS за теплової денатурації. Показано, що інкубація PheRS при 42 С призводить до деякої зміни - спіральних ділянок в молекулах білка, зміни поверхневого заряду та вираженої агрегації молекул ферменту.

6. Виявлено, що в присутності eEF1А спостерігається відновлення електрофоретичної рухливості термоденатурованої PheRS і руйнування агрегатів ферменту, що утворюються в процесі термоденатурації, та формування біологічно активної форми PheRS.

Публікації автора:

1. Лукаш Т.О., Турківська Г.В., Негруцький Б.С., Єльська Г.В. Ренатурація фенілаланіл-тРНК синтетази фактором елонгації еЕF1A // Біополімери і клітина. - 2003. - Т. 19, № 4. - C. 350-354. Особистий внесок здобувача – проведення експериментів із вивчення впливу eEF1A на активність термоінактивованої PheRS, аналіз наукових даних та написання статті проводилось за безпосередньої участі дисертантки.

2. Lukash T.O., Turkivska H.V., Negrutskii B.S., El’skaya A.V. Chaperone-like activity of mammalian elongation factor eEF1A: Renaturation of aminoacyl-tRNA synthetases // Int. J. Biochem. Cell Biol. – 2004. – Vol. 36, № 7. – P. 1341-1347. Особистий внесок здобувача – самостійне проведення експериментів із вивчення впливу eEF1A на активність термоінактивованих SerRS і PheRS, аналіз наукових даних та написання статті проводилось за безпосередньої участі дисертантки.

3. Лукаш Т.О., Турківська Г.В., Єльська Г.В. Відновлення активності аміноацил-тРНК синтетаз вищих еукаріотів та їх стабілізація в присутності рибосом // Біополімери і клітина. – 2004. – Т. 20, № 4. - С. 316-320. Особистий внесок здобувача – проведення частини експериментів із вивчення впливу 80S рибосом на активність IleRS і LeuRS у складі мультиферментного комплексу ARS та на активність термоінактивованої PheRS, власноруч написано частину статті.

4. Лукаш Т.О. Еукаріотний фактор елонгації 1А руйнує агрегати фенілаланіл–тРНК синтетази // Біополімери і клітина. – 2006. – Т. 22, № 1. – С. 29-32. Особистий внесок здобувача – самостійно проведено експерименти із кругового дихроїзму та світлорозсіяння нативної, денатурованої та ренатурованої в присутності фактора елонгації 1А PheRS, власноруч написано основну частину статті.

5. Лукаш Т.О., Турківська Г.В. Шапероноподібні властивості компонентів білоксинтезувальної системи // Біополімери і клітина. – 2005. – Т. 21, № 5. – С. 381-390. Особистий внесок здобувача – в роботі підсумовано всі наявні відомості по шапероноподібним властивостям компонентів апарату трансляції та наведено власні результати, аналіз наукових даних та написання статті проводилось за безпосередньої участі дисертантки.

6. Турківська Г.В., Лукаш Т.О., Коваленко М.Й. Ренатурація аміноацил-тРНК синтетаз фактором елонгації трансляції еЕF1A // Матеріали VIII Українського біохімічного з’їзду. Український біохімічний журнал. – 2002. - Т.74, №4б - C. 60. Особистий внесок здобувача – самостійне проведення експериментів із вивчення впливу eEF1A на активність термоінактивованих SerRS і PheRS.

7. Lukash T.O. Chaperone-like activity of mammalian elongation factor eEF1A: Renaturation of aminoacyl-tRNA synthetases // Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics. – Kyiv (Ukraine), 2003. – P. 96. Особистий внесок здобувача – самостійне проведення експериментів із вивчення впливу eEF1A на активність термоінактивованих SerRS і PheRS та стабілізуючого впливу eEF1A на активність PheRS за умов термоденатурації.

8. Лукаш Т.О. Ренатурація фенілаланіл-тРНК синтетази фактором елонгації трансляції еЕF1A // Міжгалузева конференція молодих науковців. Український біохімічний журнал. - 2003. - Т.75, №5. - C. 203–204. Особистий внесок здобувача – самостійне проведення експериментів із вивчення впливу eEF1A на активність термоінактивованої PheRS та стабілізуючого впливу eEF1A на активність PheRS за умов термоденатурації.

9. Lukash T.O., Turkivska H.V., Negrutskii B.S., El’skaya A.V. Renaturation of aminoacyl-tRNA synthetases by translational elongation factor eEF1A and ribosomes // First Ukrainian Congress for Cell Biology. – Lviv (Ukraine), 2004. – P. 381. Особистий внесок здобувача – самостійне проведення експериментів із вивчення впливу eEF1A та на активність термоінактивованої PheRS та впливу 80S рибосом на активність IleRS і LeuRS у складі мультиферментного комплексу ARS.

10. Lukash T.O., Turkivska H.V., Negrutskii B.S., El’skaya A.V. Chaperone-like activity of mammalian elongation factor eEF1A: Renaturation of aminoacyl-tRNA synthetases // International Conference of Aminoacyl-tRNA Synthetases: Ancient Molecules for Future Biology and Medicine. – Seoul (Korea), 2004 - P. 139. Особистий внесок здобувача – самостійне проведення експериментів із вивчення впливу eEF1A на активність термоінактивованих ARS.