Анотація до роботи:

Рогова О.О. Роль центрів організації мікротрубочок у стійкості до ізопропіл-N-фенілкарбамату мутантів Nicotiana sylvestris L. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.11– цитологія, клітинна біологія, гістологія. – Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, Київ, 2008.

Шляхом селекції in vitro з використанням g-опромінення отримано мутантні лінії N. sylvestris зі стійкістю до ізопропіл-N-фенілкарбамату (ІФК) – гербіциду фенілкарбаматного ряду. Стійкість до ІФК у отриманих мутантів підтверджена за допомогою тестів на здатність листових експлантів мутантних ліній регенерувати рослини і їх калусних клітин виживати на середовищах із селективною концентрацією ІФК, а також за допомогою генетичного, морфологічного, цитологічного та імунофлюоресцентного аналізу. Встановлено, що набута ознака стійкості успадковується в F₁ і F₂ поколіннях мутантів як домінантна ядерна ознака. Показано, що зміни, які спричиняють стійкість до ІФК, призводять до цитогенетичних і морфологічних аномалій у розвитку чоловічої і жіночої генеративних систем, що спричиняє різке зниження насіннєвої продуктивності мутантних рослин N. sylvestris, обумовленої високою стерильністю пилку і зниженою життєздатністю насіннєвих зачатків, відповідно. Показано, що формування трьохполюсних веретен поділу і розгалужених фрагмопластів одночасно з порушенням розподілу -тубуліну є результатом фрагментації центрів організації мікротрубочок (ЦОМТів) ІФК, що підтверджує вплив даного гербіциду лише на ЦОМТи рослин. Встановлено, що поява чисельних апоптичних порушень з наступною деполімеризацією мікротрубочок в клітинах рослин N. sylvestris у відповідь на обробку нокодазолом є прямим доказом впливу даного бензимідазолу на мікротрубочки. На підставі порівняльного аналізу вищезазначених результатів встановлено, що в основі стійкості клітин мутантних ліній рослин N. sylvestris до ІФК лежать зміни в структурі білкового комплексу ЦОМТів.

У ході дисертаційної роботи було отримано та охарактеризовано мутантні лінії N. sylvestris, стійкі до гербіциду N-фенілкарбаматного ряду – ІФК, та встановлено можливі причини їх стійкості до даної сполуки на підставі порівняння особливостей впливу N-фенілкарбаматів та бензимідазолів на організацію та функціонування мікротрубочок і ЦОМТів в клітинах контрольних та мутантних ліній N. sylvestris.

1. Шляхом селекції in vitro з використанням g-опромінення отримано мутантні лінії N. sylvestris, які характеризуються стійкістю до 30 мкМ ІФК. Встановлено, що рівень стійкості до гербіциду у отриманих мутантів є в 7 раз вищим у порівнянні з контролем.

2. Показано, що аномалії в розвитку чоловічої генеративної системи (порушення формування веретена поділу і його орієнтації в ході мейозу) та жіночої генеративної системи (неоднорідність та асинхронність розвитку насіннєвих зачатків) мутантних ліній N. sylvestris є причиною низької продуктивності насіння, обумовленою як напівстерильністю пилку, так і низькою життєздатністю насіннєвих зачатків.

3. Результати генетичного аналізу свідчать про менделевский характер успадкування ознаки стійкості до ІФК у проаналізованих само- та перехресно запилених мутантів N. sylvestris. Встановлено, що стійкість до ІФК успадковується в F₁ і F₂ поколіннях мутантів N. sylvestris як домінантна ядерна ознака.

4. Встановлено, що формування свелінгу та поява трьохполюсних мітотичних фігур у відповідь на обробку ІФК (30 мкМ) в клітинах коренів контрольних рослин N.sylvestris (Kсв = 37,39±8,05% – середнє значення в меристематичній зоні та в зоні елонгації коренів) та відсутність будь-яких порушень в клітинах мутантів є результатом підвищеної стійкості їх ЦОМТів до ІФК.

5. Показано, що підвищена стійкість кортикальних і мітотичних мікротрубочок у клітинах мутантних ліній рослин, оброблених ІФК (30 мкМ), при одночасному формуванні багатополюсних веретен поділу і розгалужених фрагмопластів в клітинах контрольних ліній зумовлена відсутністю прямої дії ІФК на мікротрубочки.

6. Показано, що порушення розподілу -тубуліну в клітинах контрольних ліній N. sylvestris (більш дисперсна локалізація в інтерфазних клітинах та локалізація в місцях розщеплення ЦОМТів в клітинах з багатополюсним мітозом) при одночасному збереженні його специфічної локалізації в клітинах мутантних ліній (в примембранній області і на периферії ядра в інтерфазних клітинах та на полюсах веретена поділу в мітотичних клітинах) після обробки ІФК (30 мкМ), є результатом пошкодження структури білкових комплексів ЦОМТів даним гербіцидом, а не мікротрубочок.

7. Встановлено, що поява чисельних апоптичних порушень з наступною деполімеризацією мікротрубочок в клітинах контрольних і мутантних ліній N.sylvestris у відповідь на обробку нокодазолом (бензимідазольною сполукою) є прямим доказом безпосереднього впливу нокодазолу на мікротрубочки, що свідчить на користь відсутності спільного сайту зв’язування для нокодазолу і ІФК на молекулі тубуліну.

8. В цілому, на підставі порівняння особливостей організації та функціонування мікротрубочок і ЦОМТів в клітинах контрольних та мутантних ліній N. sylvestris, оброблених нокодазолом та ІФК, підтверджено вплив даних сполук або на мікротрубочки, або на білкові комплекси ЦОМТ, відповідно, що опосередковано свідчить про участь останніх, зокрема шляхом певних структурних змін, у формуванні стійкості отриманих мутантів до ІФК.

Публікації автора:

1. Yemets A., Stelmakh O., Kundelchuk O., Blume Ya.B. Obtaining and analysis of isopropyl-N-phenyl carbamate resistant lines of Nicotiana species // Cell Biol. Int. – 2003. – Vol. 27, № 3. – P. 307–310.

2. Стельмах О.А, Кравець Е.А., Емец А.И., Блюм Я.Б. Особенности репродуктивного развития мутантов Nicotiana sylvestris, устойчивых к изопропил-N-фенилкарбамату // Цитология и генетика. – 2005. – Т. 39, № 6. – C. 15–23.

3. Стельмах О.А., Емец А.И., Блюм Я.Б. Мутанты Nicotiana sylvestris L., устойчивые к изопропил-N-фенилкарбамату, обладают повышенной стабильностью ЦОМТов // Цитология и генетика. – 2007. – Т. 41, № 6. – C. 3–10.

4. Yemets A., Stelmakh O., Blume Ya.B. Effects of the herbicide isopropyl-N-phenyl carbamate on microtubules and MTOCs in lines of Nicotiana sylvestris resistant and sensitive to its action // Cell Biol. Int. – 2008. – V. 32, № 4. – P. 1–7. doi:10.1016/j.cellbi.2008.01.012.

5. Yemets A., Stelmakh O., Kravets E. A., Blume Ya.B. Early PCD events in male gametophyte development of isopropyl-N-phenyl carbamate resistant Nicotiana sylvestris mutant lines // BMC Plant Biol. – 2005. – Vol. 5. – P. S38 33–S38 36. doi:10.1186/1471-2229-5-S1-S38.

6. Yemets A., Stelmakh O., Blume Ya.B. Nocodazole provokes an apoptosis in isopropyl-N-phenyl carbamate resistant and sensitive Nicotiana lines but in two different ways // BMC Plant Biol. – 2005. – Vol. 5. – P. S37 30–S37 33. doi:10.1186/1471-2229-5-S1-S37.

7. Yemets A.I., Stelmakh O.A., Blume Ya. B. Testing of plant MTOCs by antibodies against animal antigen // Abstr. of 16^th European Cytoskeleton Forum Meeting. – Maastricht, the Netherlands, 2001. – P. 112.

8. Yemets A.I., Stelmakh O.A., Blume Ya. B. Probing of the components of plant microtubule organizing centers with specific antibodies // Abstr. of Int. Symp. “Intracellular Signalling in Plant and Animal Systems” . – Kyiv, Ukraine, 2001. – P. 115.

9. Stelmakh O., Kundelchuk O., Yemets A. Production and analysis of Nicotiana mutants with resistance to herbicide isopropyl-N-phenylcarbamate // Abstr. of II Ukrainian-Bulgarian Workshop on Plant Biotechnology. – Yalta, Ukraine, 2002. – P. 28.

10. Стельмах О., Ємець А., Кундельчук О., Блюм Я.Б. Цитологічний аналіз чутливих та стійких до ізопропіл-N-фенілкарбамату ліній Nicotiana sylvestris // Тези доповідей VIII конференції молодих вчених. – К., 2002. – С. 75.

11. Yemets A.I., Stelmakh O., Kravets E., Nyporko A., Blume Ya IPC-resistant Nicotiana lines as a tool for investigation of phenylcarbamate and benzimidazole interaction with plant tubulin // Abstr. of Annual Meeting of ASPB “Plant Biology 2003”. – Honolulu, Hawaii, USA, 2003. – P. 235.

12. Stelmakh O., Blume Ya.B., Yemets A. Influence of benzimidazole on root growth and cell division in phenylcarbamate-resistant and sensitive Nicotiana lines // Abst. of 6^th Int. Symp. on Structure and Function of Roots. – Stara Lesna, Slovakia, 2003. – P. 32.

13. Stelmakh O.A., Nyporko A.Yu., Yemets A.I., Kravets E.A., Blume Ya.B. Isopropyl-N-phenyl carbamate resistant lines of Nicotiana as a model for investigation of molecular mechanisms of plant resistance to phenylcarbamates and benzimidazoles // Abstr. of VIII Int. Conf. “The Biology of Plant Cells In Vitro and Biotechnology”. – Saratov, Russia, 2003. – P. 302.

14. Stelmakh O., Yemets A., Kravets E., Blume Ya.B. Evidence of PCD in male gametophyte of isopropyl-N-phenylcarbamate resistant Nicotiana mutants // Abstr. of Int. Scien. Conf. “Molecular genetics, genomics and biotechnology”. – Minsk, Belarus, 2004. – P. 352.

15. Yemets A., Stelmakh O., Blume Ya.B. Isopropyl-N-phenylcarbamate herbicide resistant Nicotiana lines and their response on benzimidazole effect // Abstr. of Int. Scien. Conf. “Molecular genetics, genomics and biotechnology”. – Minsk, Belarus, 2004. – P. 353.

16. Stelmakh O. A, Yemets A. I, Blume Ya.B. Effects of isopropyl-N-phenyl carbamate herbicide on Nicotiana microtubules and microtubule organizing centers // Abstr. of Int. Symp. “The plant cytoskeleton: genomic and bioinformatics tools for biotechnology and agriculture”. – Yalta, Ukraine, 2006. – P. 89–95.

17. Стельмах О.А., Емец А.И., Блюм Я.Б. Роль микротрубочек и центров их организации в формировании устойчивости к изопропил-N-фенилкарбамату у мутантов Nicotiana sylvestris // Тезисы докладов II Съезда Общества клеточной биологии. – Санкт-Петербург, Россия, 2007. – Т. 49, № 9. – C. 797.

18. Стельмах О.О., Ємець А.І., Блюм Я.Б. Роль мікротрубочок і центрів їх організації у формуванні стійкості до ізопропіл-N-фенілкарбамату клітин мутантів Nicotiana sylvestris // Тези доповідей II З’їзду українського товариства клітинної біології. – К., 2007. – С. 256.