Анотація до роботи:

Ушакова Г.О. Роль гепарансульфат- та гіалуронат-зв’язуючих білків у розвитку та адаптації мозку. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 – біохімія. – Харківській національній університет ім. В.Н.Каразіна, Харків, 2005 р.

Дисертація присвячена вивченню ролі макромолекул, що специфічно зв’язують гепарансульфат та гіалуронат під час розвитку мозку щурів та людини за нормальних умов й при наявності впливу гіперфенілаланінемії ¹³¹І-індукованого материнського гіпотиреозу, опромінення низької інтенсивності, соматогенного післяопераційного болю. Запропоновані підходи до кількісного визначення загального рівня гепарансульфат- та гіалуронат-зв’язуючих білків. Встановлено характер залежності морфогенезних подій під час розвитку мозку від загального рівня гепарансульфат- та гіалуронат-зв’язуючої властивості водорозчинних, мембраноасоційованих, мембранних та екстрацелюлярних/ цитоскелетних компонентів. Під час ранніх етапів розвитку мозку характерне співвідношення гепарансульфат-зв’язуючої та гіалуронат-зв’язуючої активності 1:10. Показано ступінь залежності адгезивності нейронів гіпокампу від кількості гепарансульфату та гіалуронату в субстраті культури. Установлена наявність гепарансульфат- та гіалуронат-зв’язуючих компонентів у ядрах проліферуючих та мігруючих нервових клітин. Очищені мембраноасоційовані гепарансульфат-зв’язуючі білки з мозку новонароджених щурів (19 і 28 кДа) та мембранні гіалуронат-зв’язуючі білки з ембріонального мозку людини (250 і 20 кДа). Наведені докази збільшення загального рівня глікозаміноглікан-зв’язуючої активності білків на початку розвитку гіперфенілаланінемії. Представлені докази участі гепарансульфат- та гіалуронат-зв’язуючих рецепторів у адаптаційних процесах в умовах впливу ¹³¹І-індукованого материнського гіпотиреозу та опромінення низької інтенсивності (одноразового та фракціонованого в дозі 0,25 Гр). Визначена участь гепарансульфат-зв’язуючих білків задньої частини великих півкуль мозку щура в центральних механізмах соматогенного післяопераційного болю.

Ключові слова:ЦНС, гепарансульфат-, гіалуронат-зв’язуючі білки, розвиток мозку, гіперфенілланінемія, опромінення низької інтенсивності, біль.

1. Рівень загальної активності як гепарансульфат-, так й гіалуронат-зв’язуючих білків щодо зв’язування відповідних глікозаміногліканів у мозку щурів та людини є характерною величиною, що змінюється специфічно протягом морфогенезу, залежна від віку, статі, та функцій відділів мозку за нормальних умов та при дії патогенних чинників.

2. Розроблена система визначення кількісної характеристики загальної здатності компонентів мозку щодо зв’язування гепарансульфата та гіалуроната та їх клітинної й субклітинної локалізації за допомогою синтезованих кон’югатів (гепарансульфат-ПХ та гіалуронат-ПХ).

3. Оптимальними умовами для кількісного аналізу глікозаміноглікан-зв’язуючої здатності білків мозку щурів та людини in vitro є:

сорбція білків до полістеролу в умовах низької іонної сили та рН 5,8;

блокування вільних місць зв’язування на полістеролі білками, що не зв’язують відповідні глікозаміноглікани;

запобігання наявності в реакційній суміші детергентів, особливо на момент сорбції;

зв’язування кон’югату з дослідними компонентами в умовах низької іонної сили (концентрація як Са²⁺, так й Mg²⁺ не повинна перевищувати 4 мМ, оптимальна концентрація Na⁺ чи К⁺ 60 мМ й рН 3 чи рН 6,8 становять для гепарансульфата, та 20 мМ й рН 5-5,5 – для гіалуроната).

Аналогічні умови найсприятливіші й для проведення вуглеводгістохімічного аналізу за допомогою визначених кон’югатів.

4. Під час ембріогенезу щурів та людини найвищій рівень гепарансульфат- та гіалуронат-зв’язуючої активності білків характерний в області вентрикулярного та субвентрикулярного шарів нервової трубки, що формується, особливо для компонентів плазматичної мембрани та ядра.

5. Присутність як гепарансульфата, так й гіалуроната в субстраті моношарової культури нейронів гіпокампу щурів змінює адгезивність нейронів та термін морфогенезних подій. Використання субстрату, що містить більш ніж 20 мкг/мл вказаних глікозаміногліканів, призводить до зменшення сорбції нейронів до субстрата, зменшення кількості нейрональних молекул клітинної адгезії та змін її топографії на плазматичній мембрані, затримці диференціації нейронів.

6. У мозку новонароджених щурів високий рівень гепарансульфат- та гіалуронат-зв’язуючої активності білків залишається тільки у відділах мозку, де ще відбуваються процеси активної проліферації та міграції нервових клітин. Найвищім є рівень у фракції цитоскелетних/ екстрацелюлярних білків мозочку (450±80 нг зв'яз. ГП/мг ЗБ та 4000±120 нг зв’яз. ГК/мг ЗБ). Під час ранніх етапів розвитку мозку характерне співвідношення гепарансульфат-зв’язуючої та гіалуронат-зв’язуючої активності 1:10. Найбільший внесок у загальний рівень глікозаміноглікан-зв’язуючої активності білків вносять компоненти ядерного скелету проліферуючих та мігруючих клітин, в меншій кількості - складові міжклітинного матриксу та плазматичної мембрани.

7. У мозку дорослих щурів за нормальних умов рівень гепарансульфат- та гіалуронат-зв’язуючої активності білків значно менший (1-50 нг зв'яз. ГАГ/мг ЗБ) й є постійною величиною для кожного відділу мозку в залежності від статі. У самців ця активність в середньому на 22% вище, ніж у самиць, в усіх дослідних відділах мозку, за виключенням гіпокампу.

8. Мембраноасоційовані гепарансульфат-зв’язуючі білки, що очищені з мозку новонароджених щурів, мають молекулярну масу 19 та 28 кДа. Очищений мембранний гіалуронат-зв’язуючий білок з ембріонального мозку людини молекулярною масою 250 кДа представлений основним поліпептидом у 85 кДа та двома мінорними - 68 і 36 кДа.

9. В умовах гіперфенілаланінемії під час постнатального розвитку щурів збільшення гепарансульфат- та гіалуронат-зв’язуючої активності білків має місце на ранніх етапах розвитку в відділах мозку, де ще відбувається формування структури (у мозочку - майже в два рази). Це може спричинити зміни розвитку мозку та подальші ментальні порушеня.

10. Уведення ¹³¹I в дозі 150 мкКі самицям на різних стадіях вагітності призводить до зниження кількості проліферуючих клітин у зовнішньому та внутрішньому гранулярних шарах кори мозочку їх новонароджених та посилення гепарансульфат- та гіалуронат-зв’язуючої активності білків, з максимумом змін при введенні ¹³¹I на 16 добу ембріогенезу.

11. Вплив тотального рентгенівського опромінення в дозі 0,25 Гр викликає хвилеподібні зміни загальної глікозаміноглікан-зв’язуючої активності білків у мозку дорослих щурів. Одноразове опромінення призводить до різноспрямованих змін даного показника впродовж 24 год. у стовбурних структурах та поступовому підвищенню його впродовж 120 год. у корі, з поверненням до норми на 168 год. після опромінення; максимальні зміни характерні для лімбічної системи; ступінь даних змін залежить від статі. Фракціоноване опромінення призводить до підвищення загальної глікозаміноглікан-зв’язуючої активності білків у стовбурних структурах мозку, та поступового зниження у корі з максимальним відхиленням від контролю на 168 год. після опромінення; ці зміни у мозку самців та самиць мають вірогідно однаковий характер.

12. Післяопераційна гіпералгезія спричиняє незначне підвищення (у 1,3-1,5 рази) гепарансульфат-зв’язуючої активності сечовиннорозчинних білків із задньої частини півкуль мозку щура. Застосування знеболюючих препаратів (морфіну та кетаміну) за 5 хв. до операції запобігає таким змінам.

Публікації автора:

Статі

Одноособові

1. Ушакова Г.А. Регуляторная роль гиалуроната // Сборник научных трудов «Регуляция в живых системах», Днепропетровск, ДГУ. - 1998. - С. 136-141.

2. Ушакова Г.А. Экспрессия глиального фибриллярного кислого белка в период неоплазии. Вестник ДГУ. Биология, Экология. - 1998. - Вып.4. - С. 41-46.

3. Ushakova G. Postnatal dynamics of the heparin-binding activity of rat cerebellar cells // Нейрофизиология/Neurophysiology. - 1999. - Vol. 31, № 2. - P. 140-141.

4. Ушакова Г.А. Участие кальпаина II в деградации промежуточных филаментов астроглии в условиях нейрогенного стресса // Нейрохимия. 1999. - Т.16, № 3. - С. 230-234.

5. Ушакова Г.О. Зміна гіалуронат-зв’язуючої активності білків мозку щурів за дією малих доз радіації // Вісник Дніпропетровського університету. Біологія. Екологія. - 2000. - Вип. 8, том 1. - С. 100-105.

6. Ушакова Г.А. Сравнительная характеристика гиалуронат-связывающей активности в различных органах и отделах головного мозга крысы и человека // Вісник Дніпропетровського університету. Біологія. Екологія. - 2002. - Вип. 10, том 1. - С. 94-99.

7. Ушакова Г.О. Чинники, що впливають на афінність білків мозку ссавців до гіалуронату в умовах in vitro // Вісник Дніпропетровського університету. Біологія. Екологія. - 2003. - Вип. 11, том 2. - С. 170-175.

У співавторстві

8. Ushakova G., Skibo G., Berezin V. Neural cell adhesion molecule (N-CAM) distribution may predict the effect of neurotoxins on the brain // Toxicon. - 1995. - Vol. 33, № 4. - P. 577-581.

9. Долженко М.И., Качур В.А., Колкова Е.А., Ткач В.Л., Ушакова Г.А., Лепехин Е.А. Гликозаминогликан-связывающие белки в развивающейся нервной системе млекопитающих // Вестник Днепропетровского университета. Биология. Экология. - 1996. - Вып. 2. – С. 40-47.

10. Ткач В.Л., Ушакова Г.А., Лепехин Е.А.. Гиалуронат-связываюшая активность головного мозга крысы в период постнатального развития // Вісник Дніпропетровського університету. Біологія-Екологія. - 1997. - Вып. 3. - С. 56-61.

11. Ushakova G., Gubkina H., Kachur V., Lepekhin E. Effect of experimental hyperphenylalaninemia on the postnatal rat brain // Int. J. Devl. Neuroscience. -1997. - Vol. 15, № 1. - P. 29-36.

12. Ushakova G, Nikonenko I., Skibo G., Witt M., Lepekhin E. The role of hyaluronate in morphogenesis of the neurons // Нейрофизиология/ Neurophysiology. - 1997. - Vol. 29, № 1. - P. 21-27.

13. Usenko V., Kornilovska I., Lizogubov V., Apostolov E., Gubkina H., Ushakova G., Lepekhin E. Some morphological changes in the thyroid glad during exerimental hyperphenilalaninemia // Anatomical Rec. - 1997. - Vol. 248. - P. 251-258.

14. Ткач В.Л., Ушакова Г.А., Лепехин Е.А. Выделение и очистка мембранного гиалуронатсвязывающего белка из мозга эмбрионов человека // Укр. биохим. журн. - 1998. - Т. 70, № 5. - С. 69-74.

15. V.Usenko, E. Lepekhin, V. Lyzogubov, I. Kornilovska, G. Ushakova and M. Witt. The influence of low doses 131-I-induced maternal hypothyroidism on the development of rat embryos // Exp. Toxic Pathol. - 1999. - Vol.51. - P. 223-227.

16. Білоусова Т.В., Ушакова Г.О. Визначення проліферативної активності клітин мозку новонароджених щурів // Вісник ДДУ. Біологія. Екологія. - 1999. - Вип. 6. - С.36-42.

17. Belousova T.V., Ushakova G.A. Changes in the proliferative activity in the brain of offspring rats induced by the influence of ¹³¹I on the maternal organism // Neurophysiology. - 1999. - Vol.31, № 4. - P. 280-281.

18. Кобеляцкий Ю.Ю., Ушакова Г.А. Влияние морфина и кетамина на нейрональную и глиальную пластичность при послеоперацинной гипералгезии // Журн. АМН України. - 1999. - Т.5, № 4. - С. 732-742.

19. Ушакова Г.А., Березин В.А., Неруш П.А. Изменение уровня NCAM в различных структурах головного мозга крыс, подвергавшихся стрессированию, и восстановление этого уровня под влиянием галоперидола // Нейрофизиология/Neurophysiology. - 2000. - Т. 32, № 5. - С. 366-371.

20. Белоусова Т.В. , Ушакова Г.А. Гепаринсвязывающие белки в мозгу крысы // Нейрофизиология/Neurophysiology. - 2001. - T. 33, № 6. -С. 387-392.

21. Ушакова Г.А., Корниловская И.Н., Кобеляцкий Ю.Ю. Участие гепарина и гепаринсвязывающих белков мозга крыс в процессе гипералгезии // Біополімери і клітина. - 2001. - Т. 17, № 5. - С. 428-433.

22. Ushakova G.A., Nikonenko I.R., Nikonenko A.G., Skibo G.G. Extracellular matrix heparin induces alteration of the cell adhesion during brain development // Neurochemistry International. - 2002. - Vol. 40. - P. 277-283.

23. Белоусова Т.В. , Ушакова Г.А. Изменение гепарин-связывающей активности белков мозга крыс после однократного воздействия ионизирующего излучения в дозе 0,25 Гр. // Радиационная биология. Радиоэкология. - 2002. - Т. 42, №3. - С. 268-273.

24. Ушакова Г.О., Білоусова Т.В. Вплив одно- та двовалентних іонів на загальну гепарин-зв’язуючу активність білків з мозку новонароджених щурів // Вісник Дніпропетровського університету. Біологія. Екологія. - 2002. - Вип. 10, том 2. - С. 45-50.

25. Белоусова Т.В. , Ушакова Г.А. Динамика изменений гепаринсвязывающей активности белков мозга крыс после фракционированного воздействия ионизирующего излучения низкой интенсивности // Радиационная биология. Радиоэкология. - 2003. - Т.43, № 1. - С. 44-48.

Тези доповідей

26. Ushakova G.A., Lepekhin E.A., Gubkina E.A., Kachur V. Quantification of NCAM, GFAP and hyaluronate-binding activity in postnatal rat brain during experimental hyperphenylalaninemia // 15^th Meeting of the International Society for Neurochemistry, Kyoto, July 2-7, 1995. - J. of Neurochemistry. - 1995. - Vol. 65,S. - P. 182.

27. Ushakova G.A., Lepekhin E.A., Tkath V.L. Hyaluronate-binding activity in human and rat tissue // 23rd Meeting of FEBS, Basel, August 13-18. - 1995. - P.182.

28. Ushakova G.A., Gubkina E.A., Lepekhin E.A. The cell adhesion alteration during postnatal rat brain development under hyperphenylalaninemic conditions // Second Biennial Research Conference on “Molecular biology of cellular interactions”, Lenggries, Germany, October 9-15. - 1995. - P.23.

29. Ushakova G. The effect of stress conditions to cell adhesion // 8^th Sardinian Conference on Neuroscience, Cagliary, Italy, May 24-28, 1995. - Behavioral Pharmacology J. - 1995. - Vol. 31, S. - P. 108.

30. Tkach V., Ushakova G., Lepekhin E. Hyaluronate-binding activity in development of rat cerebellum and cerebral hemispheres // 24 Meeting of FEBS, Barselona. - 1996. - P. 132.

31. Ushakova G., Tkach V.,Lepekhin E. Glycosaminoglycan-binding activity during postnatal rat brain development // 11^th Biennial Meeting of the International Society for Developmental Neuroscience, Tampere, Finland, 30 July – 3 August, 1996. - Int.J. of Devl. Neuroscience. - 1996. - Vol. 14, S1. - P. 89.

32. Ткач В.Л., Ушакова Г.А., Лепёхин Е.А. Влияние малых доз радиоактивного йода на гиалуронат-связывающую активность мозжечка крысы в период пренатального развития // Матеріали 4 Міжнародної Конференції «Франція и Україна, науково-практичний досвід у контексті діалогу національних культур», Дніпропетровськ. - 1997. - С. 37.

33. Яснило Ю.А., Исмаилова Ю.А., Ушакова Г.А. Влияние материнского гипотиреоза на пролиферацию клеток мозжечка потомства // Матеріали 4 Міжнародної Конференції «Франція и Україна, науково-практичний досвід у контексті діалогу національних культур», Дніпропетровськ. - 1997. - С. 149-150.

34. Tkach V.L., Ushakova G.A., Lepekhin E.A. Effect of maternal hypothyroidism on hyaluronate-binding activity during prenatal rat brain development // 16^th ISN/28^th ASN Meeting, Boston, USA, July 20-26, 1997. - J. of Neurochem. - 1997.- Vol. 69, S. - P. 165.

35. Ushakova G.A., Ismailova Y.A., Lepekhin E.A. Effect of maternal hypothyroidism to cell adhesion during early stage of rat brain development // 16^th ISN/28^th ASN Meeting, Boston, USA. July 20-26, 1997. - J. of Neurochem. - 1997. - Vol. 69, S. - P. 166.

36. Ушакова Г.О. Участь глікозаміногліканів у процесах морфогенезу мозку ссавців під час постнатального розвитку // Матеріали YII Українського Біохімічного З’їзду, Київ, 1997. - С. 169-170.

37. Ткач В.Л., Імаїлова Ю.О., Ушакова Г.О., Лепехін Є.О. Мембранний гіалуронат-з’язуючий білок ембріонального мозку людини // Матеріали YII Українського Біохімічного З’їзду, Київ, 1997. - С. 167-168.

38. Ткач В.Л., Ушакова Г.А., Лепёхин Е.А. Влияние радиоактивного йода на гиалуронатсвязывающую активность мозга крысы в период пренатального развития // Материалы 3-го Съезда по радиационным исcледованиям, Москва, Россия, 14-17 октября 1997. - С. 263-264.

39. Ушакова Г.А. Влияние малых доз радиоактивного йода на развитие мозга млекопитающих // Материалы 3-го Съезда по радиационным иследованиям, Москва, Россия, 14-17 октября 1997. - С. 266-267.

40. Белоусова Т.В., Ушакова Г.А. Влияние радиоактивного йода на развитие мозга млекопитающих // V Міжнародна конференція «Франція та Україна, науково-практичний досвіт у контексті діалогу національних культур», Дніпропетровськ. - 1998. – T. 2. - С. 74-75.

41. Ушакова Г.А. Регуляція деградації цитоскелету нервових клітин іонізованим кальієм // 2 З’їзд Укр. біофізичного товариства, Харків, 29 червня – 3 липня 1998. - С. 74.

42. Ushakova G.A. The possible role of NCAM in synaptic plasticity in connection with learning // Proceeding of the IV European Research Conference: Neural Mechanisms of Learning and Memory, Acquafredda di Maratea, Italy, May 9-4, 1998. - P.27.

43. Ushakova G.A. Hyaluronate and neural development // Forum of European Neuroscience, Berlin, June 27 – July 1, 1998. - Eur. J. Neuroscience. - 1998. - Vol. 10, S10. - P.163.

44. Lepekhin E., Ushakova G., Usenko V., Lyzogubov V., Kornilovska I., Witt M. Low dose of I-131 disturbs rat brain development // Forum of European Neuroscience, Berlin, June 27 – July 1, 1998.- Eur. J. Neuroscience - 1998. - Vol. 10, S10. - P. 164.

45. Ushakova G. Carbohydrate-binding activity under hyperphenylalaninemia // Twelfth General Meeting of the European Society for Neurochemistry, St. Petersburg, Russia, July 19-24, 1998. - J. Neurochem. - 1998. - Vol.71, S. - P. 66.

46. Kobeliatsky Y, Ushakova G. Interaction among expression NCAM and excitatory mechanism of hyperalgesia on the experimental model of postoperative pain // 1998 Annual Meeting of the Canadian Pain Society, Saskatchewan, Canada, May 28-30, 1998. - Pain Res. Management. - 1998. - Vol.3, N 1. - P.61.

47. Kobeliatsky Y, Ushakova G. Experimental postincisional pain: hyperalgesia, behavioral responses and synaptic plasticity // 10^th European Congress of Anaesthesiology, Frankfurt/Main, Germany, June 30 – July 4, 1998. - J. AINS. - 1998. - Vol.33, S3. - P.546.

48. Belousova T., Ushakova G. Purification of heparin-binding proteins from rat brain // 4^th International Congress In The Decade of the Brain, Gdansk, Poland, 2-5 September 1999. - P.45.

49. Ushakova G.A., Nikonenko I.R., Nikonenko A.G., Skibo G.G.. Free heparin in substrates takes part in the regulation of neurite outgrowth // 15 th National Meeting of British Neuroscience, London, 11-14 April 1999. - P. 8.11.

50. Ushakova, T. Belousova, E. Lepekhin. Heparin-binding proteins take part in regulation of brain cells proliferation // Fifth IBRO World Congress of Neuroscience. Jerusalem, Israil, 11-15 July 1999. - P. 125.

51. G. Ushakova, I. Nikonenko, A. Nikonenko, G. Skibo. Heparin induces alteration of N-CAM distribution on the neuron membrane // 17^th ISN/13^th ESN Meeting, Berlin, Germany, August 8-14, 1999. - J. Neurochem. - 1999. - Vol. 73, S. - P. 58.

52. Ushakova G., Kobeliatsky Y. N-CAM level alteration in the rat brain under an experimental model of post-operative pain // Forum of European Neuroscience 2000, Brighton, UK, 24-28 June, 2000. - Eur. J. of Neuroscience. - 2000. - Vol. 12, S11. - P.122.

53. Belousova T., Ushakova G. Changes of total heparin-binding activity of the rat brain proteins after low dose irradiation // Joint Meeting of the ISN/ASN, Buenos Aires, August 26-31, 2001. J. Neurochem. - 2001. - Vol. 78, Supl. 1. - P. 83.

54. Belousova T., Ushakova G. Participation of heparinoids in the proliferation control of the nervous cells // International Symposium Intracellular Signaling in Plant and Animal Systems, Kyiv, Ukraine, 9-14 September, 2001. - P.50.

55. Белоусова Т.В., Ушакова Г.А. Фракционированное воздействие ионизирующего излучения низкой интенсивности изменяет гепарин-связывающую активность белков мозга // IV Съезд по радиационным исследованиям (радиобология, радиоэкология, радиационная безопасность). Москва, Россия. 20-24 ноября 2001. - С. 326.

56. Ushakova G. Heparin-binding activity of proteins in the human and rat brain during embryonic and postnatal development // 14^th Biennial Meeting of the International Society for Developmental Neuroscience, Sydney, Australia, January 31 – February 4, 2001. - Int. J. Devl. Neuroscience. - 2001. Vol. 19. - P. 731.

57. Белоусова Т.В., Ушакова Г.А. Очистка мембранноассоциированных и экстрацеллюлярных гепаринсвязывающих белков мозга крыс // VIII Український біохімічний з’їзд, Чернівці, 1-3 жовтня 2002. - Укр. біохім. журн. -2002. - Т. 74, № 4б. - С. 21-22.

58. Білоусова Т., Ушакова Г.О. Афіність зв’язування гепарину до мембраннеасоційованих білків мозку новонароджених щурів // Тези доповідей III З’їзду Українського біофізичного товариства, 8-11 жовтня 2002 року. - С. 132.

59. Ушакова Г.О. Вплив іонізуючої радіації низької інтенсивності на загальну гіалуронат-зв’язуючу активність білків мозку щурів // III съезд по радиационным исследованиям, Киев 21-25 мая 2003. - С.73.

60. Белоусова Т.В., Ушакова Г.О. Изменение гепаринсвязывающей активности белков в различных структурах мозга крыс при фракционированном действии рентгеновского излучения в малой дозе // III съезд по радиационным исследованиям, Киев 21-25 мая 2003. - С.21.