Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 – біохімія. – Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, Київ, 2004.
Дисертація присвячена виділенню, очищенню та порівняльній характеристиці специфічних тіамінзв'язуючих білків мозку, печінки та нирок щурів.
В результаті проведених досліджень вперше виділено тіамінзв'язуючі білки (ТЗБ) з тканин печінки та нирок щурів. Здійснено подальші дослідження властивостей описаного раніше тіамінзв'язуючого білка з мозку щурів.
Встановлено, що ТЗБ досліджуваних органів не відрізняються за молекулярною масою, яка становить близько 100 кДа згідно з даними гель-фільтрації на сефадексі G-150. За даними електрофорезу в 10% ПААГ в присутності DS-Na білки складаються з двох субодиниць з молекулярною масою 63 кДа і 35 кДа. Досліджувані ТЗБ подібні за амінокислотним складом.
Показано, що тіамінзв'язуючі білки специфічно взаємодіють з [14С]тіаміном. Цей процес для всіх трьох білків носить насичуючий характер у діапазоні концентрацій тіаміну 0,05-50 мкМ. Для ТЗБ характерна наявність двох типів ділянок зв'язування – з більшою та меншою спорідненістю до тіаміну (для ТЗБ печінки Кd1=0,63±0,16 мкМ, Кd2 = 8,6±1,8 мкМ, ТЗБ нирок Кd1 = 0,45±0,11 мкМ, Кd2 =7,5±1,5 мкМ, ТЗБ мозку Кd1 = 0,30± 0,17 мкМ, Кd2 = 8,1±2,6 мкМ).
З'ясовано, що всі ізольовані ТЗБ є біфункціональними: окрім здатності специфічно взаємодіяти з тіаміном їм властива ферментативна активність. Вони гідролізують фосфорні ефіри тіаміну, найбільш активно з яких – тіамінтрифосфат.
Встановлена субклітинна локалізація тіамінзв'язуючих білків. ТЗБ мозку локалізований переважно в синаптичних везикулах та плазматичній мембрані синаптосом. Місцем локалізації тіамінзв'язуючих білків печінки та нирок є плазматична мембрана клітин.
1. Дляз'ясування молекулярних процесів, які лежать в основі некоферментних функцій тіаміну, суттєве значення мають дослідження тіамінзв'язуючих білків ссавців. На сьогоднішній день є достеменні відомості лише про тіамінзв'язуючий білок мозку щурів, а питання про наявність подібних білків в інших тканинах та їхню можливу роль залишалось відкритим. Нами вперше виділено та охарактеризовано тіамінзв'язуючі білки печінки та нирок щурів. Встановлено, що вони специфічно взаємодіють з тіаміном та беруть участь в обміні його біологічно активних похідних, і ці функції є універсальними для всіх досліджуваних тканин організму.
2. Встановлено, що тіамінзв'язуючі білки печінки та нирок аналогічно білку мозку мають молекулярну масу близько 100 кДа. Всі досліджувані тіамінзв'язуючі білки містять у своєму складі дві різні субодиниці з молекулярною масою 63 кДа та 35 кДа.
3. Показано, що тіамінзв'язуючі білки з різних тканин близькі за амінокислотним складом. Для них зафіксовано високий вміст моноамінодикарбонових амінокислот, характерних для більшості тіамінзв'язуючих білків, та гідрофобних амінокислот, які властиві білкам мембранного походження.
4. Тіамінзв'язуючі білки мають високу спорідненість до тіаміну та дві ділянки зв'язування ліганду з Кd1 0,63±0,16 і Кd2 8,6±1,8 мкМ для тіамінзв'язуючого білка печінки, нирок – Кd1 0,45±0,11 і Кd2 7,5±1,5 мкМ та мозку – Кd1 0,30±0,17 і Кd2 8,1±2,6 мкМ.
5. Доведено, що тіамінзв'язуючі білки мозку, печінки та нирок за своєю природою є біфункціональними: вони здатні як специфічно взаємодіяти з тіаміном, так і гідролізувати його фосфорні ефіри, особливо тіамінтрифосфат. Реакція гідролізу тіамінтрифосфату залежить від наявності іонів Mg2+ та оптимальна при рН 7,4.
6. В мозку тіамінзв'язуючий білок локалізований переважно в синаптичних везикулах та плазматичній мембрані синаптосом, а в тканинах печінки та нирок – в плазматичній мембрані клітин.
Публікації автора:
1. Янчій О.Р., Пархоменко Ю.М., Донченко Г.В. Характеристика тіамінзв'язуючих білків мозку, печінки та нирок щурів // Укр. біохім. журн. – 2001. – Т.73, №3. – С. 107–111 (здобувачем проведено експериментальні дослідження, аналіз одержаних результатів, їх математичну обробку, підготовлено статтю до друку).
2. Пархоменко Ю.М., Протасова З.С., Янчий О.Р., Хосла К., Донченко Г.В. // Локализация тиаминсвязывающего белка в синаптосомах из головного мозга крыс // Нейрофизиология. – 2001. – Т.33, №3. – C. 161–165 (здобувач приймав участь у проведенні експериментів та виконував математичну обробку отриманих даних).
3. Янчий О.Р., Пархоменко Ю.М., Донченко Г.В. Внутриклеточная локализация тиаминсвязывающих белков печени и почек крыс // Укр. біохім. журн. – 2003. – Т.75, №6. – С. 111–114 (здобувачем проведено експериментальні дослідження, аналіз та інтерпретацію одержаних даних, їх математичну обробку, підготовлено матеріали статті до друку).
4. Yanchiy O.R., Parkhomenko Yu.M., Donchenko G.V. // Acethylcholine interaction with rat brain thiamine binding protein // Fifth IBRO world congress of neuroscience. – Jerusalem, Israel, 1999. – P.170.
5. Янчій О.Р., Пархоменко Ю.М., Донченко Г.В. Властивості тіамінзв'язуючих білків мозку, печінки та нирок щурів // Укр. біохім. журн. – 2000. – Т.72, №6. – С. 122–123.
6. Янчий О.Р., Пархоменко Ю.М., Донченко Г.В. Биологическая активность тиаминсвязывающих белков мозга, печени и почек крыс // Материалы Междунар. научн. конф. "Биологически активные соединения в регуляции метаболического гомеостаза". – Гродно: НАН Беларуси, 2000. – Т.2. – С.321–323.
7. Янчий О.Р., Пархоменко Ю.М., Донченко Г.В. Специфические тиаминсвязывающие белки из различных органов крыс // 5ая пущинская конференция молодых ученых “Биология – наука 21го века”. – Пущино, 2001. – С.70–71.
8. Янчій О.Р. Дослідження тіамінтрифосфатазної активності тіамінзв'язувальних білків мозку, печінки та нирок щурів // Укр. біохім. журн. – 2002. – Т.74, №4а (додаток 1). – С. 94.
