Анотація до роботи:

Єгоров М. І. Морфофункціональний стан сперматозоїдів собак в залежності від умов кріоконсервування. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.19 - кріобіологія. Інститут проблем кріобіології і кріомедіцини НАН України, Харків, 2007.

Дисертаційна робота присвячена вивченню впливу компонентів кріозахисних середовищ і умов кріоконсервування на збереження морфо-функціональних властивостей сперматозоїдів собак до і після процесу заморожування-відтавання.

Вплив кріопротекторів ГЛ, ЭГ, 1,2-ПД, ДМСО, ДМФА, а також яєчного альбуміну на мембрани сперматозоїдів собак вивчали за допомогою методів флуоресцентних зондів і міток. Використовували флуоресцентний зонд ФМЕ (3-гидрокси-4-N,N-диметиламінофлавон), флуоресцентну мітку Tasman Green-404.

Вивчення впливу компонентів кріозахисних середовищ (тріс-буфера, фруктози, глюкози, лактози, ГЛ, ЭГ, 1,2-ПД, ДМСО, ДМФА, суміші ЭГ і ДМФА) на морфофункціональні характеристики сперматозоїдів собак проводили на етапах до кріоконсервування і після заморожування-відтавання клітин.

Виявлено, що у ряді кріопротекторів (ГЛ, ЕГ,
1,2-ПД, ДМСО, ДМФА) ДМФА є найменьш токсичним кріопротектором для сперматозоїдів собак, в середовищі, що містить тріс-буфер в концентрації 0,25 М, фруктозу в концентрації 0,05 М, проявляє найкращий кріозахист в поєднанні з яєчним альбуміном відносно сперматозоїдів собак (р 0,05), що обумовлено його физико-хімічною структурою, а саме гідрофільно-гідрофобним балансом його молекули.

Показано, що збільшення концентрації ДМФА в кріозахисному середовищі, призначеному для кріоконсервування сперматозоїдів собак вище за 8 % може негативно впливати на структуру ліпідних складових біомембран..

Практичне використання існуючих методів кріоконсервування сперматозоїдів собак не отримало значного поширення внаслідок їх недосконалості. У дисертаційній роботі наведено теоретичне та експериментальне узагальнення досліджень впливу умов кріоконсервування на морфофункціональний стан сперматозоїдів собак на етапах: до та після заморожування в залежності від доданих кріопротекторів, їх хімічної структури та умов інкубації клітин, до та після заморожування в залежності від складу кріозахисного середовища. Експериментально обґрунтовані підходи до створення кріозахисного середовища з метою підвищення збереження сперматозоїдів собак в процесі кріоконсервування. На підставі цього розроблено метод кріоконсервування сперматозоїдів собак, який дозволяє зберігати високий відсоток функціонально повноцінних клітин після заморожування-відтавання.

1. Встановлено, що відокремлення клітин від фракцій плазми еякуляту на етапі підготовки сперматозоїдів до кріоконсервування позитивно впливає на виживаність гамет після заморожування-відтавання. Виявлено, що заморожування-відтавання відокремлених фракцій плазми еякуляту дозволяє використовувати їх для розбавлення кріоконсервованих і відігрітих сперматозоїдів в процесі запліднення з метою створення умов наближених до природних.

2. Показано, що з досліджених вуглеводів (фруктоза, глюкоза, лактоза) фруктоза у складі кріозахисного середовища у концентрації 0,05 М дозволила зберегти найкращу життєздатність сперматозоїдів собак як до, так і після процесу заморожування-відтавання.

3. Встановлено, що ефект взаємодії вивчених кріопротекторів як з ліпідним бішаром ліпосом, сформованих з сумарних ліпідів сперматозоїдів собак, так ї з мембранами клітин зумовлений гідрофільно-гідрофобним балансом молекул дослідних сполук. Виявлено концентраційно-залежний характер їх дії на ліпідний бішар. Показано, що збільшення концентрації ДМФА в кріозахисному середовищі, призначеному для кріоконсервування сперматозоїдів собак вище за 8 % може негативно впливати на структуру ліпідних складових біомембран..

4. Виявлено, що у ряді кріопротекторів (гліцерин, етиленгліколь,
1,2-пропандіол, диметилсульфоксид N,N-диметилформамід)
N,N-диметилформамід спричинює найменьше падіння рухливості сперматозоїдів собак на етапі підготовки до кріоконсервування клітин, проявляє найкращий кріозахист при кріоконсервуванні сперматозоїдів собак, що обумовлено його физико-хімічною структурою, а саме гідрофільно-гідрофобним балансом його молекули.

5. Розроблене середовище, що містить N,N-диметилформамід у концентрації 1 М в поєднанні з яєчним альбуміном в концентрації 1 % у тріс-фруктозному розбавлювачі, яке проявляє ефективніший кріозахист в порівнянні із стандартним середовищем, що містить жовток курячих яєць в концентрації 20 % (v/v) і ГЛ в концентрації 1 М і режим кріоконсервування сперматозоїдів собак в запропонованому кріозахисному середовищі, який дозволяє одержати життєздатність даних клітин на рівні 55 % безпосередньо після відтавання і 30 % через 6 годин інкубації в кріозахисному розчині при температурі 6^оС.

Публікації автора:

1. Егоров М.И., Копейка Е.Ф., Линник Т.П., Кучков И.Н. Влияние глицерина, этиленгликоля на морфофункциональные характеристики сперматозоидов собак на разных этапах криоконсервирования // Пробл. криобиологии. – 2004. - № 4. - С. 13 – 20

2. Линник Т.П., Егоров М.И., Дюбко Т.С., Белоножко А.П. Влияние компонентов криозащитных сред на жизнеспособность сперматозоидов собак в процессе криоконсервирования // Пробл. криобиологии. – 2005. – Т. 15,
№ 4. - С. 645 – 656

3. Єгоров М.І., Дюбко Т.С., Ліннік Т.П., О. П. Бєлоножко,
Єрмоленко І. Г., Семенова О. Н., Паценкер Л. Д., Пивоваренко В. Г., Поврозін Є.А. Нові флуоресцентні барвники як зонди для дослідження сперматозоїдів собак у кріозахисних середовищах // Пробл. криобиологии. – 2006. – Т. 16, № 1. - С. 13 – 23

4. Кошевой В. П., Фурда И. В., Егоров М. И. Влияние N,N-диметилформамида, этиленгликоля и их смеси на криоустойчивость сперматозоидов собак // Пробл. криобиологии. – 2006. – Т. 16, № 3. – С. 245-253

5. Пат. № 68172 А (Україна) МПК 7 А 01 N 1/02 Спосіб отримання сперми собак. / Грищенко В.І., Копійка Є.Ф., Єгоров М.І., Кучков І.М., Черкащина І.В. Заявл. 31.10.2003. Публ.15.07.04. Бюл.7, с.4.26.

6. Пат. № 8590 (Україна) МПК 19 А 01 N 1/02 Середовище Єгорова для кріоконсервування сперматозоїдів собаки./ Єгоров М. І., Грищенко В. І., Ліннік Т. П., Новиков О. М. Заявл. 10. 01. 2005. Публ. 15. 08. 2005.

7. Пат. № 13898 (Україна) МПК G 01 N 1/28 Спосіб оцінки змін макроструктури зневоднених білкових розчинів. / Марченко В.С., Дюбко Т.С., Грищенко В.І., Марченко М.В., Ліннік Т.П., Єгоров М.І., Бєлоножко О.П., Соколик О.О. Заявл. 11. 11. 2005. Публ. 17. 04. 2006. Бюл. № 4.

8. Линник Т.П., Егоров М.И., Дюбко Т.С., Титарь В.П., Тишко Т.В., Семенова О.Н., Пивоваренко В.Г. Влияние криопротекторов классов амидов и диолов на сперматозоиды собаки по данным метода флуоресцентных зондов // 1 Укр. наук. конф. „Проблеми біол.. і мед. фізики”, 20-22 вер. 2004 р., Харків. – С. 138.

9. Егоров М.И., Любко Т.С., Линник Т.П., Терещенко А.В., Артеменко А.Б., Єрмоленко И.Г. Изучение влияния связываня флуоресцентно меченого альбумина со сперматозоидами // Міжн. наук.–практ. конф. „Наукові дослідження – теорія та експеримент, 2005”, 16-20 травня 2005 р., Полтава. – С. 18-19.

10. Егоров М.И., Линник Т.П., Дюбко Т.С., Белоножко А.П. Исследование криозащитной активности эндоцеллюлярных криопротекторов в процессе криоконсервирования сперматозоидов собак // Конф. мол. уч. ІПКіК «Холод в біології та медицині - 2005», Пробл.криобиологии. – 2005. – Т. 15, № 4. –С. 736-737