Анотація до роботи:

Петрушко М.П. Морфофункціональні, цитологічні і молекулярно-генетичні характеристики нативних і кріоконсервованих ембріонів людини. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.19 – кріобіологія. - Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків, 2006.

У дисертаційній роботі представлена розробка принципів морфофункціонального, цитогенетичного і молекулярно-генетичного аналізів ембріонів, що включає їх морфологічні характеристики, стадію розвитку, здатності до поновлення мітозу і генетичну діагностику, які дозволяють використовувати для перенесення у порожнину матки пацієнток морфологічно і генетично повноцінні ембріони. Встановлено, що оптимальною стадією для кріоконсервування преімплантаційних ембріонів людини є зигота. Поетапне розморожування зигот у 1 - 3-ю добу перед ембріотрансфером та наступне культивування дозволяють переносити в порожнину матки ембріони різних термінів розвитку, що збільшує імовірність їх імплантації. Кріоконсервовані ембріони у порівнянні з нативними характеризуються різними темпами морфогенетичного розвитку. Після кріоконсервування ембріони демонструють прискорені темпи дроблення, що виражається в раннім формуванні бластоцисти і збільшенні загальної кількості бластомерів. Фактори кріоконсервування впливають на здатність бластоцисти до виходу з zona pellucida, що вимагає проведення процедури допоміжного "вилуплення", збільшують кількість патологічних станів мітозів і індукують виникнення пікнотичних ядер. У преімплантаційних ембріонах людини після кріоконсервування зростає частота анеуплоїдії хромосом групи G, відбувається збільшення частоти мозаїцизму і поліплоїдії. Необхідним є проведення преімплантаційної генетичної діагностики кріоконсервованих ембріонів з метою перенесення у порожнину матки пацієнтки генетично повноцінних ембріонів.

Сучасні методи кріоконсервування і принципи оцінки морфофункціонального збереження преімплантаційних ембріонів людини не дозволяють визначити вплив факторів кріоконсервування на їх генетичний апарат. Тому в дисертаційній роботі на підставі детального аналізу морфофункціональних, цитологічних та молекулярно-генетичних характеристик визначений вплив вихідного стану преімплантаційних ембріонів людини на їх життєздатність після кріоконсервування. У дисертації наведено теоретичне узагальнення та нове вирішення наукової проблеми генетичної безпеки використання кріоконсервованих преімплантаційних ембріонів людини у допоміжних репродуктивних технологіях при лікуванні безпліддя.

1. Розроблена система комплексної оцінки морфологічних характеристик шляхом аналізу розміру та ступеня адгезії бластомерів, наявності фрагментації, цитоплазматичних вакуолей, стану zona pellucida, яка визначає внесок індивідуальних характеристик і дозволяє використовувати їх як біомаркери кріочутливості ембріона.

   Морфологія ембріонів до кріоконсервування позитивно корелює з їх виживанням після відігрівання. У зв'язку з цим ембріони без цитоплазматичних фрагментів, які мають світлу дрібнозернисту цитоплазму, інтактну zona pellucida, бластомери сферичної форми, придатні для кріоконсервування.

   Встановлено, що оптимальною стадією для кріоконсервування преімплантаційних ембріонів людини є зигота. Кріоконсервування ембріонів людини, що знаходяться на даній стадії, варто проводити через 20-22 год після інсемінації. Поетапне розморожування зигот у 1-3-ю добу перед використанням у допоміжних репродуктивних технологіях та наступне культивування дозволяють переносити в порожнину матки пацієнтки ембріони різних термінів розвитку, що збільшить імовірність їх імплантації.

   Кріоконсервовані ембріони у порівнянні з нативними характеризуються різними темпами морфогенетичного розвитку. Після кріоконсервування ембріони демонструють прискорені темпи дроблення, які виражаються у ранньому формуванні бластоцисти і збільшенні загальної кількості бластомерів. Фактори кріоконсервування впливають на здатність бластоцисти до виходу з zona pellucida, що вимагає проведення процедури допоміжного "вилуплення".

   Молекулярно-цитогенетичний аналіз при гібридизації клонованих послідовностей ДНК із метафазними та інтерфазними хромосомами in situ дозволив визначити високу генетичну гетерогенність преімплантаційних ембріонів людини. У преімплантаційних ембріонах людини після кріоконсервування зростає частота анеуплоїдії хромосом групи G, збільшується частота мозаїцизму і поліплоїдії.

   Селекція ембріонів за станом хроматину бластомерів є індикатором ефективності кріоконсервування і надійним критерієм оцінки функціональної активності генома бластомерів.

   Фактори кріоконсервування індукують фрагментацію бластомерів з утворенням без'ядерних ділянок цитоплазми, що перешкоджають нормальному розподілу бластомерів. Ембріони людини на різних стадіях розвитку виявляють різну морфофункціональну цілість після кріоконсервування, що виражається в збільшенні ступеня фрагментації бластомерів.

   Грубі хромосомні аберації в нативних і деконсервованих ембріонах виявляються у виді порушення каріо- та цитокинезу: утворення мультинуклеарних бластомерів, фрагментів бластомерів, що містять нерівномірні маси хроматину. Фактори кріоконсервування індукують злиття окремих бластомерів з утворенням поліплоїдних клітин. Тому необхідна преімплантаційна генетична діагностика кріоконсервованих ембріонів з метою використання у допоміжних репродуктивних технологіях генетично повноцінних ембріонів.

   Фактори кріоконсервування знижують мітотичний індекс наступного поділу після кріоконсервування, збільшують кількість патологічних станів мітозів і індукують виникнення пікнотичних ядер.

   Основне хромосомне порушення при цитогенетичному аналізі незапліднених ооцитів – анеуплоїдія. Із збільшенням кількості незрілих ооцитів, отриманих при пункції фолікулів, підвищується ризик хромосомної патології; з віком у жінок спостерігається нестабільність хромосомного набору репродуктивних клітин, що обумовлює проведення додаткового цитогенетичного аналізу.

   Для поліпшення умов культивування преімплантаційних ембріонів in vitro була розроблена система сокультивування на клітинах кумулюсу і гранульози, яка дозволила зменшити частоту фрагментації нативних і кріоконсервованих ембріонів людини.

   Розроблені науково обґрунтовані принципи комплексної оцінки нативних та кріоконсервованих ембріонів за морфологічними характеристиками, здатністю до поновлення мітозу, швидкістю морфогенетичних процесів з урахуванням результатів преімплантаційної генетичної діагностики можуть бути використані в якості прогностичних критеріїв вірогідності розвитку повноцінних ембріонів при їх застосуванні у допоміжних репродуктивних технологіях.

Публікації автора:

1. Грищенко В.И., Петрушко М.П., Геродес А.Г., Пиняев В.И. Цитогенетический анализ гамет и эмбрионов в программе экстракорпорального оплодотворения // Проблемы репродукции. - 1996.- № 1.- С.63-67.

   Грищенко В.И., Петрушко М.П., Пиняев В.И., Луцкая Л.И., Терпячая И.В., Крамар М.И., Юрченко Г.Г. Использование спермиев, хранившихся в условиях гипотермии, для реинсеминации неоплодотворенных ооцитов в программе ЭКО // Проблемы криобиологии. - 1998.- № 3.- С.48-52.

   Грищенко В.И., Геродес А.Г., Петрушко М.П., Пиняев В.И Влияние нативной и криоконсервированной фолликулярной жидкости человека на оплодотворяющую способность спермиев и развитие эмбрионов человека in vitro // Проблемы криобиологии.- 1999.- № 1.- С.66-68.

   Грищенко В.И., Геродес А.Г., Петрушко М.П., Никитченко Ю.В. Роль антиоксидантной системы нативной и криоконсервированной фолликулярной жидкости человека в сохранении биологических свойств спермиев человека // Биологический вестник.- 1999. - Т.3, № 1,2.- С.36-40.

   Грищенко В.И., Геродес А.Г., Петрушко М.П., Пиняев В.И., Грищенко Н.Г. Использование фолликулярной жидкости человека на этапе культивирования гамет и эмбрионов в программе ЭКО // Проблемы репродукции. - 1999.- №6.- С.43-46.

   Грищенко В.И., Петрушко М.П., Пиняев В.И. Влияние количества и качества эмбрионов на результативность программы ЭКО // Проблемы репродукции.- 2000.- № 1.- С.44-47.

   Грищенко В.І., Жегунов Г.Ф, Петрушко М.П., Хроменкова О.Б. Причини низької ефективності програми ЗІВ: цитогенетичний аспект // Педиатрия, акушерство и гинекология. - 2000.- № 2.- С.107-110.

   Петрушко М.П. Использование криоконсервированных эмбрионов человека во вспомогательных репродуктивных технологиях // Проблемы криобиологии. - 2000.- № 1.- С. 71-76.

   Грищенко М.Г., Петрушко М.П., Пиняев В.И., Рязанцев В.В. Роль антиоксидантных ферментных систем фолликулярной жидкости в процессах оплодотворения ооцитов при лечении бесплодия с использованием вспомогательных репродуктивных технологий // Медицина сьогодні і завтра. - 2001.- №.3.- С.102-104.

   Грищенко В.И., Геродес А.Г., Петрушко М.П., Пиняев В.И., Грищенко Н.Г. Оптимизация программы экстракорпорального оплодотворения путем использования биологически активных сред: Зб. наук. праць Асоціації акушерів-гінекологів України. - Київ, 2001.- С. 173-175.

   Грищенко В.І., Петрушко М.П., Піняєв В.І. Лікування неплідності методом екстракорпорального запліднення // Журнал Академії Медичних Наук України. - 2001.- № 3.- С.569-575.

   Grischenko V.I., Petrushko M.P., Pinyaev V.I., Terpyachaya I.V. Use of sperm stored under hypothermic conditions for reinsemination of unfertilized oocytes in an IVF programme // Cryo-Letters. - 2001.- Vol.22, №4.- P.235-240.

   Грищенко М.Г., Петрушко М.П., Піняєв В.І., Рязанцев В.В. Процеси перекисного окислення ліпідів, антиоксидантні ферментативні системи фолікулярної рідини та процеси запліднення ооцитів in vitro при використанні допоміжних репродуктивних технологій // Педiатрiя, акушерство i гiнекологiя. - 2002.- № 2.- С.103-107.

   Пат. 48932 А Україна МПК G 01N33/00. Спосіб прогнозування запліднення ооцитів при лікуванні безплідності в програмі запліднення in vitro / М.Г. Грищенко, М.П. Петрушко., В.І. Піняєв., В.В. Рязанцев / Заявл. 08.07.02. Опубл. 15.08.02. Бюл. №8. - С.4.146.

   15. Петрушко М.П. Цитогенетический анализ неоплодотворенных ооцитов человека // Цитология и генетика. - 2003.- № 6.- С.50-56.

   16. Грищенко В.И., Петрушко М.П., Геродес А.Г., Терпячая И.В. Беременность и роды после трансплантации деконсервированных эмбрионов человека // Проблемы криобиологии. - 2003.- № 3.- С.99-102.

   17. Грищенко В.И., Петрушко М.П., Ерогова Н.Н., Пиняев В.И. Преждевременная конденсация хромосом спермиев в ооцитах человека, оплодотворенных in vitro // Цитология и генетика. - 2004.- №2.- С.55-60.

   18. Грищенко В.И., Петрушко М.П., Ерогова Н.Н., Пиняев В.И. Морфофункциональные и цитогенетические характеристики трехпронуклеарных зигот человека в программе ЭКО // Цитология и генетика. - 2004.- №1.- С.21-26.

   19. Петрушко М.П. Возникновение многоядерных бластомеров эмбрионов человека после криоконсервирования // Проблемы криобиологии. - 2004.- № 1.- С.55-62.

   20. Петрушко М.П. Цитогенетический анализ нативных и деконсервированных эмбрионов человека методом флюоресцентной гибридизации in situ // Экспериментальная и клиническая медицина. - 2004.- № 3.- С.339-344.

   21. Пат. 4909 Україна МПК А01N1/02. Спосіб кріоконсервування ембріонів людини // B.I. Грищенко, М.П. Петрушко, Т.М. Гурiна // Заявл. 24.05.04. Опубл. 15.02.05.- Бюл.2.

   22. Петрушко М.П. Скорость морфогенеза эмбрионов человека после криоконсервирования // Пробл. криобиологии.- 2005.- № 1.- С.56-62.

   23. Петрушко М.П. Морфологические характеристики нативных и криоконсервированных эмбрионов человека // Экспериментальная и клиническая медицина. - 2005.- № 2.- С.45-50.

   24. Петрушко М.П. Роль фаз клеточного цикла и морфологии пронуклеусов в жизнеспособности нативных и криоконсервированных зигот человека // Проблемы криобиологии. - 2005.- № 2.- С.202-206.

   25. Грищенко В.И., Геродес А.Г., Петрушко М.П., Терпячая И.В., Грищенко Н.Г. Лечение бесплодия у пациентов с синдромом поликистозных яичников (СПКЯ) методом ОИВ с использованием криоконсервированных эмбрионов: Зб. наук. праць співробітників НМАПО ім. П.Л.Щупика. - Київ, 2006.- С.107-110.

   26. Грищенко В.И., Петрушко М.П., Пиняев В.И., Грищенко Н.Г. Генетические аспекты переноса криоконсервированных эмбрионов: Зб. наук. праць співробітників НМАПО ім. П.Л.Щупика. - Київ, 2006.- С.181-184.

   27. Петрушко М.П., Пиняев В.И., Луцкая Л.И., Терпячая И.В. Роль клеток кумулюса в фертилизации, дроблении и эфективности программы ЭКО: Сб. науч. трудов симпозиума с международ. участием "Бесплодие. Вспомогательные репродуктивные технологии".- Київ, 1997.- С.112-114.

   28. Грищенко В.И., Пиняев В.И., Петрушко М.П., Луцкая Л.И., Терпячая И.В. Лечение бесплодия методом экстракорпорального оплодотворения: Актуальные вопросы репродуктологии и криомедицины. – Харків, 1998.- С.135-138.

   29. Геродес А.Г., Пиняев В.И., Луцкая Л.И., Петрушко М.П., Терпячая И.В. Влияние концентрации половых гормонов в фолликулярной жидкости человека на результативность ОИВ: Сб.науч. трудов симпозиума с межд. участием "Бесплодие. Вспомогательные репродуктивные технологии". - Київ, 1999.- С.22-25.

   30. Петрушко М.П. Криоконсервирование эмбрионов человека: выбор оптимального метода: Сучасні аспекти репродуктології, перинатальної медицини та кріобіології.- Харків, 2003.- С.191-196.

   31. Grischenko V.I., Chub N.N., Petrushko M.P., Pinyaev V.I., Lutskaya L.I., Terpyachaya I.V., Yurchenko G.G. Morphofunctional, cytogenetic characteristics of gamates, zygotes and embryos after exposure to hypothermia: Cryo-95. The 32-rd Annual Meeting of the Society for Cryobiology. - Madison, 1995.- P.2-52.

   32. Grischenko V.I., Lutskaya L.I., Khromushkin K.N., Petrushko M.P. Effect of low temperature preservation on human oocytes at different stage of development: Cryo-96. The 33-rd Annual Meeting of the Society for Cryobiology. - Indianapolis, 1996.- P.106.

   33. Грищенко В.И., Геродес А.Г., Никитченко Ю.В., Петрушко М.П., Пиняев В.И. Роль антиоксидантной системы фолликулярной жидкости, нативной и хранившейся при низких температурах в сохранении биологических свойств спермиев человека // Цитология. - 1999.- Т.41, №9.- С.813-814.

   34. Grishenko V.I., Pinyaev V.I., Petrushko M.P. Co-culturing of human embryos with cumulus cells // Journal of Assisted Reproduction and Genetics. - 1999.- Vol.16, №.3.- P.156.

   35. Gerodes A.G., Yurchenko G.G., Petrushko M.P., Todorov P. Effect of antispermal antibodies in follicular fluid on the results of IVF: 9^th International Symposium of Immunulugy of Reproduction. - Varna, 2000.- P.83-84.

   36. Петрушко М.П. К вопросу о необходимости принятия статуса эмбриона: Тези доповідей міжн. симпозіуму “Біоетика на порозі Ш тисячоліття”.- Харків, 2000.- С.109-110.

   37. Grishenko V.I., Petrushko M.P., Gerodes A.G., Pinyaev V.I. Application of cryopreserved biologically active fluids during embryos culturing in the IVF Program: CRYO-2001. 38^th meeting of the society for cryobiology. - 2001.- P.184.

   38. Petrushko M.P., Erogova N.N. Tripronuclear zygotes after in vitro fertilization of human oocytes: Abstracts book of Conference on molecular biology and genetics. - Kyiv, 2001.- P.184.

   39. Грищенко Н.Г., Петрушко М.П., Пиняев В.И., Семенченко А.Ю. Изучение концентрации простагландинов PG F2a и PG E 2 в фолликулярной жидкости в физиологических овуляторных циклах и при лечении бесплодия в программе оплодотворения in vitro: Зб. тез “Медицина третього тисячоліття”. - Харків, 2001.- С.128-129.

   40. Грищенко В.И., Петрушко М.П., Геродес А.Г., Пиняев В.И. Криоконсервированные биологически активные среды как составлявляющая часть среды культивирования гамет и эмбрионов in vitro // Проблемы криобиологии. - 2001.- №.3.- С.62.

   41. Петрушко М.П., Геродес А.Г., Никитченко Ю.В. Биологически активные жидкости организма человека: сокультивирование с гаметами и эмбрионами человека in vitro: Міжнародна наук.-практ. конференція "Нові технології отримання біологічно активних речовин".- Алушта, 2002.- С.180-181.

   42. Petrushko M.P., Grishenko V.I., Erogova N.N., Pinyaev V.I. Cytogenetic analysis of cryopreserved human embryos: CRYO-2003. 40^th meeting of the society for cryobiology. - Coimbra, 2003. - P.173.

   43. Грищенко В.И., Петрушко М.П., ПиняевВ.И., Ерогова Н.Н., Гурина Т.М., Луцкая Л.И. Полиплоидия бластомеров эмбрионов человека после криоконсервирования: Тези доповідей Ш міжнарод. наук.-практ. конференції "Наука і соціальні проблеми суспільства: медицина, фармація, біотехнологія". - Харків, 2003. - C.258.

   44. Петрушко М.П., Грищенко В.И., ПиняевВ.И., Ерогова Н.Н. Генетический анализ нативных и криоконсервированных эмбрионов человека // Проблемы репродукции. - 2003.- №5.- С.50.

   45. Петрушко М.П. FISH-анализ нативных и криоконсервированных эмбрионов человека: Материалы международ. конференции "Сохранение генетических ресурсов" // Цитология. - 2004. - Т.46, №.9. - С.833-835.

   46. Грищенко В.И., Копейка Е.Ф., Петрушко М.П. Проблемы криобиологии и сохранение генетических ресурсов: Материалы международ. конференции "Сохранение генетических ресурсов" // Цитология. - 2004.- Т.46, №.9.- С.784-785.

   47. Петрушко М.П. Морфофункциональные характеристики эмбрионов человека как прогностический критерий программы ЭКО: Зб. тез “Медицина третього тисячоліття”. - Харків, 2004.- С.65.

   48. Grishenko V.I., Petrushko M.P., Pinyaev V.I., Erogova N.N. Morphological characteristics and morphogenesis rate of human embryos after cryopreservation: Cryo-2004. The 41-th Annual Meeting of the Society for Cryobiology. - Beijing, 2004.- P.145.

   49. Петрушко М.П. "Ошибки ЭКО" - цитогенетический аспект: Тезисы 14 международной конференции РАРЧ "Репродуктивные технологии сегодня и завтра" // Проблемы репродукции. - 2004.- С.113-114.

   50. Petrushko M.P., Grishenko V.I., Erogova N.N., Pinyaev V.I. Frequency of formation and total cell number of blastocyst after cryopreservation: Вook of Abstracts Serono Symposia International. - Stressa, 2004.- P.5.

   51. Петрушко М.П., Пиняев В.И., Ерогова Н.Н Криоконсервирование эмбрионов человека на стадии зиготы: Материалы международ. конференции "Репродуктивные технологии сегодня и завтра".- Чебоксары, 2005. - С.38-39.

   52. Петрушко М.П., Пиняев В.И., Ерогова Н.Н. Мозаицизм нативных и криоконсервированных эмбрионов человека: Тези П Українського конгресу з міжнарод. участю “Метаболічні спадкові захворювання” // Ультразвукова перинатальна діагностика.- 2005.- № 20. - С.88.

   53. Петрушко М.П., Пиняев В.И., Ерогова Н.Н. Оценка состояния хроматина в бластомерах после криоконсервирования // Проблемы криобиологии. - 2005. - № 3. - С.248.