Анотація до роботи:

Скрипник А. В. Молекулярно-генетична диференціація мікобактерій, виділених в Україні, та їх філогенетичні взаємозв’язки. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук за спеціальністю 16.00.03 – ветеринарна мікробіологія та вірусологія. Національний науковий центр «Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини», Харків, 2007.

Дисертація присвячена вивченню видового складу ізолятів мікобактерій з різних регіонів України, їх тинкторіальних і культурально-морфологічних властивостей, філогенетичних взаємозв’язків та розробці системи молекулярно-генетичного виявлення і видової диференціації мікобактерій.

Проведено видову диференціацію 125 штамів мікобактерій, ізольованих в 11 областях України впродовж 1982–2004 рр. Вперше описано циркуляцію в Україні Mycobacterium caprae, M.frederiksbergensе, M. engbackii, M. doricum, M. parascrofulaceum, M. hassiacum, M. confluentis, M. elephantis. Показано, що серед досліджених атипових мікобактерій (109 ізолятів) найбільш поширеними є M. аvium (34 %) та M. fortuitum (31 %).

Встановлено, що серед атипових мікобактерій від реагуючої на туберкулін ВРХ найчастіше виділяється M. аvium (32,0 % ізолятів) (зокрема M. avium subsp. hominissuis – 22,7 %) і M. fortuitum (17,3 %), які грають провідну роль у сенсибілізації ВРХ до туберкуліну для ссавців. На долю M. nonchromogenicum припадає 9,3 %, M. phlei – 8,0 %, інших 9 видів атипових мікобактерій – 33,3 %.

У результаті філогенетичного аналізу визначено три кластери: швидкозростаючі, «термотолерантні» швидкозростаючі і повільнозростаючі мікобактерії, що свідчить про генетичну детермінацію ознаки швидкості росту мікобактерій. Класифікація мікобактерій за Раньйоном не відображає філогенетичні взаємозв’язки мікобактерій.

На підставі аналізу молекулярно-генетичних методів видової диференціації і генотипування мікобактерій (ПЛР, РЕА-hsp65, споліготайпінга, ГЕПП, секвенування 16S рДНК) розроблено систему їх видової диференціації і визначення їх генетичної спорідненості за допомогою генотипування.

Розроблено метод виділення мікобактеріальної ДНК із бактеріальної маси для її використання в ПЛР і родоспецифічну тест-систему для детекції бактерій роду Мycobacterium методом ПЛР.

1. За результатами тинкторіальних, культуральних, молекулярно-біологічних та філогенетичних методів дослідження визначено видовий склад та філогенетичні взаємозв’язки мікобактерій, ізольованих у різних регіонах України; здійснено порівняльну оцінку наявних молекулярно-генетичних методів, теоретично та експериментально обґрунтовано їх застосування для видової диференціації та генотипування мікобактерій. Запропоновано систему молекулярно-генетичної детекції та видової диференціації мікобактерій, яка містить комплекс послідовного застосування полімеразної ланцюгової реакції, рестрикційно-ензимного аналізу ділянки гена groEL2 (hsp65), споліготайпінгу, гель-електрофорезу в пульсуючому полі, секвенування гіперваріабельної ділянки гена 16S рибосомальної РНК, а також культивування та мікроскопію.

2. За результатами визначення видової належності 125 штамів М. tuberculosis complex та атипових мікобактерій, виділених в Україні з 1982 по 2004 роки, уперше показано циркуляцію на її території таких видів: M. caprae, M. frederiksbergensе, M. engbackii, M. hassiacum, M. doricum, M. parascrofulaceum, M. confluentis, M. elephantis. Здійсненим уперше типованням 38 штамів M. аvium до підвидів, при цьому установлено, що співвідношення між M. avium subsp. hominissuis та M. avium subsp. avium становить 1:1.

3. Під час дослідження атипових мікобактерій, виділених від ВРХ, що реагує на туберкулін, встановлено, що головна роль у сенсибілізації ВРХ до туберкуліну належить M. аvium (32,0 % ізолятів атипових видів мікобактерій), зокрема M. avium subsp. hominissuis – 22,7 %, і M. fortuitum (17,3 %), на долю M. nonchromogenicum припадає 9,3 %, M. phlei – 8,0 %, інших 9 видів атипових мікобактерій – 33,3 %.

4. За результатами дослідження культурально-морфологічних властивостей 125 культур мікобактерій встановлено, що найшвидші темпи росту культур з одночасною можливістю докладного вивчення їхніх культурально-морфологічних властивостей можуть бути отримані за паралельного використання різних живильних середовищ: яєчних, агарвміщуючих і рідких.

5. Вивчення генетичної варіабельності досліджених культур дало можливість визначити діагностичну цінність молекулярно-генетичних методів. При цьому встановлено, що для видової ідентифікації представників комплексу М. tuberculosis ефективним є споліготайпінг, для підвидів М. avium найбільш придатним є метод ПЛР, для атипових мікобактерій – секвенування гіперваріабельної ділянки гена 16S рРНК та РЕА-hsp65, однак останній має суттєві обмеження в специфічності порівняно із секвенуванням. Використання IS 902 як специфічного маркера для диференціації M. аvium subsp. silvaticum виявилося неможливим.

6. Ефективним методом молекулярно-епізоотологічних досліджень представників М. tuberculosis complex (MTC) є споліготайпінг, за допомогою якого було диференційовано 15 штамів МТС: 12 M. bovіs і 3 M. caprae, з них 2 сполігопрофілі є унікальними. Для генотипування атипових видів мікобактерій ефективним є гель-електрофорез у пульсуючому полі, за допомогою якого у всіх 23 досліджених штамів було визначено унікальні фінгерпринтинги і встановлено високий ступінь гетерогенності штамів M. fortuitum.

7. У результаті аналізу топографії побудованого філогенетичного древа 17 видів мікобактерій виявлено наявність трьох кластерів: швидкозростаючих мікобактерій (3 види), «термотолерантних» швидкозростаючих мікобактерій (7 видів) і повільнозростаючих мікобактерій (7 видів). Класифікація мікобактерій за Раньйоном не відображає філогенетичні взаємозв’язки мікобактерій.

8. Розроблений метод виділення ДНК з бактеріальної маси мікобактерій для її використання в ПЛР не поступається за ефективністю іншим лабораторним методам, дозволяє здійснити екстракцію ДНК протягом 20 хвилин і не потребує реагентів.

9. Розроблено систему видової диференціації мікобактерій (за допомогою ПЛР, РЕА-hsp65, секвенування ділянки гена 16S рРНК, споліготайпінгу) та визначення їхньої генетичної спорідненості за допомогою генотипування (з використанням споліготайпінгу та ГЕПП).

10. На основі розрахованих олігонуклеотидних послідовностей розроблена тест-система для діагностики роду Мycobacterium, яка дозволяє виявляти 100 клітин збудника в мілілітрі, що відповідає найкращим світовим аналогам.

Публікації автора:

1. Детекція збудників інфекційних захворювань тварин за допомогою полімеразної ланцюгової реакції: Учбово-методичний посібник / Б. Т. Стегній, В. О. Головко, П. І. Вербицький, А. М. Коваленко, І. І. Белоконов, А. В. Скрипник. – Х., 2003. – 27 с. (Дисертантом проведено обробку даних та їх узагальнення)

2. Полiмеразна ланцюгова реакцiя у практиці ветеринарної медицини: Науково-методичний посiбник / Б. Т. Стегнiй, А. П. Герiлович, О. Ю. Лиманська, В. I. Болотiн, А. В. Скрипник, С. А. Сапко, Р. Ю. Анiчин // ННЦ «IЕКВМ». – Х., 2006. – 110 с. (Дисертантом проведено частину експериментальних досліджень, пошук і аналіз даних)

3. Скрыпник, А. В. Лабораторные методы диагностики туберкулеза животных и птиц: Методические рекомендации. Утверждены научно-методическим советом Государственного департамента ветеринарной медицины Украины 26 января 2005 г. / А. В.Скрыпник, Б. Т.Стегний, А. И. Завгородний. – В печати. (Дисертантом проведено експериментальні дослідження, збір і аналіз даних та їх узагальнення)

4. Значение и практическая ценность молекулярно-генетических методов детекции возбудителей инфекционных заболеваний животных / Б. Т. Стегний, В. А. Бусол, А. В. Скрыпник, А. М. Коваленко, Л. В. Коваленко, И. И. Белоконов, Р. Ю. Аничин // Ветеринарна медицина: Міжвід. темат. наук. зб. – Х., 2003. – Вип. 81. – С. 301–315. (Дисертантом проведено експериментальні дослідження і обробка даних)

5. Скрыпник, А. В. Изучение генетической вариабельности гипервариабельного участка гена, кодирующего 16S рибосомальную РНК, с помощью секвенирования изолятов Mycobacterium fortuitum и Mycobacterium parascrofulaceum, выделенных на территории Украины / А. В. Скрыпник // Ветеринарна медицина: Міжвід. темат. наук. зб. – Х., 2004. – Вип. 83. – С. 219–222.

6. Дифференциация разных видов микобактерий / Б. Стегний, K. Sachse, I. Moser, P. Mbius, А. Скрыпник // Ветеринарна медицина: Міжвід. темат. наук. зб. – Х., 2004. – Вип. 84. – С. 647–656. (Дисертантом сплановано досліди, проведено експериментальні дослідження, аналіз даних та їх узагальнення)

7. Стегний, Б. Т. Применение сполиготайпинга для детекции Mycobacterium tuberculosis complex / Б. Т. Стегний, А. М. Коваленко, А. В.Скрыпник // Ветеринарна медицина: Міжвід. темат. наук. зб. – Х., 2004. – Вип. 84. – С. 685–689. (Дисертантом сплановано досліди, проведені експериментальні дослідження, обробку даних та їх узагальнення)

8. Коваленко, А. М. Розробка ПЛР тест-системи «TubMyc-Україна» для детекції бактерій роду Mycobacterium / А. М. Коваленко, Б. Т. Стегній, А. В. Скрипник // Ветеринарна медицина: Міжвід. темат. наук. зб. – Х., 2005. – Вип. 85. – С. 528–533. (Дисертантом розроблено систему праймерів, сплановано досліди, проведено визначення специфічності, чутливості і відтворюваності, аналіз даних та їх узагальнення)

9. Индикация и дифференциация выделенных культур микобактерий / Б. Т. Стегний, I. Moser, В. М. Горжеев, А. М. Коваленко, И. И. Белоконов, А. В. Скрыпник // Підвищення продуктивності сільськогосподарських тварин: Зб. наук. праць ХДЗВА. – Х., 2005. – Т. 15. – С. 328–338. (Дисертантом проведено експериментальні дослідження, обробку даних та їх узагальнення)

10. Генотипування мікобактерій за допомогою гель-електрофорезу в пульсуючому полі / А. В. Скрипник, Б. Т. Стегній, А. І. Завгородній, В. Г. Скрипник, І. Мозер // Ветеринарна медицина: Міжвід. темат. наук. зб. – Х., 2007. – Вип. 88. – С. 196–202. (Дисертантом проведено експериментальні дослідження, обробку даних та їх узагальнення)

11. Characterization of Mycobacterium caprae isolates from Europe by mycobacterial interspersed repetitive unit genotyping / W. M. Prodinger, A. Brandstatter, L. Naumann, M. Pacciarini, T. Kubica, M. L. Oschiroli, A. Aranaz, G. Nagy, Z. Cvetnic, M. Ocepek, A. Skrypnyk, W. Erler, S. Niemann, I. Pavlik, I. Moser // Journal of Clinical Microbiology. – 2005. – Vol. 43, № 10. – P. 4984–4992. (Дисертантом проведено частину експериментальних досліджень)

12. Деклараційний патент № 3080 Україна, МКИ G01N33/00. Спосіб діагностики туберкульозу та мікобактеріозів тварин / Б. Т. Стегній, А. М. Коваленко, А. В. Скрипник, В. Г. Скрипник (Україна). – № 2004010182; заявлено 09.01.2004; опубл. 15.10. 2004, Бюл. № 10. – 2 с.

13. Деклараційний патент № 8094 Україна, МКИ G01N33/00. Спосіб виділення ДНК мікобактерій з живильних середовищ для діагностики туберкульозу та мікобактеріозів в полімеразній ланцюговій реакції / Б. Т. Стегній, А. В. Скрипник, В. Г. Скрипник (Україна). – № 200500408; заявлено 17.01.2005; опубл. 15.07.2005, Бюл. № 7. – 2 с.

14. Stegniy, B. Epidemiological situation of bovine tuberculosis in Ukraine / B. Stegniy, A. Kovalenko, A. Skrypnyk // Arbeitstagung des nationalen veterinrmedizinischen Referenzlabors fr Tuberkulose und des Referenzlabors fr Paratuberkulose: 13–14 Mai 2003, Jena, Deutschland. – 2003. (Дисертантом проведено обробку даних та часткове їх узагальнення)

15. Atypische Mykobakterien. Mglichkeiten der Diagnostik und klinische Relevanz / I. Moser, A. Skrypnik, H. Hotzel, P. Mbius, W. Erler, J. Gottschaldt, B. Baumgrtner // Arbeitskreis fr veterinrmedizinische Infektionsdiagnostik (AVID), 17–19 September 2003, Kloster Banz, Deutschland. – 2003. – S. 22. (Дисертантом проведено експериментальні дослідження і обробку даних)

16. The comparative analysis of different methods for mycobacteria typing by the example of Mycobacterium fortuitum / B. Stegniy, K. Sachse, I. Moser, H. Hotzel, A.Kovalenko, A. Skrypnyk, A. Stegniy // Materials of 6^th Conf. «Molecular biology in diagnostics of infectious diseases and biotechnology», 6 December 2003, Warsaw, Poland. – 2003. – P. 196–203. (Дисертантом сплановано досліди, проведено експериментальні дослідження, обробку даних та їх узагальнення)

17. Стегний, Б. Т. Поэтапная ПЦР тест-система для диагностики туберкулеза и микобактериозов / Б. Т. Стегний, А. М. Коваленко, А. В. Скрыпник // Актуальные проблемы эпизоотологии на современном этапе: Материалы междунар. науч.-практ. конф. – 2004., СПб. – С. 130–131. (Дисертантом проведено більшу частину експериментальних досліджень, обробку даних та їх узагальнення)

18. Mycobacterial infections in cattle in Ukraine during 2001–2005 / A. Skrypnyk, A. Zavgorodniy, B. Stegniy, I. Moser // Materials of 27^th Annual Congress of the European Society of Mycobacteriology, 9–12 July 2006, London, United Kingdom. – 2006. (Дисертантом проведено збір і аналіз даних та їх узагальнення)

19. Epizootic analysis of cattle mycobacterial infections in Ukraine during 2001–2005 / A. Skrypnyk, A. Zavgorodniy, B. Stegniy, V. Skrypnyk, I. Moser. // Arbeitstagung des nationalen Referenzlabors fr Tuberkulose und des nationalen Referenzlabors fr Paratuberkulose, 11-12 Oktober 2006, Jena, Deutschland. – 2006 (Дисертантом проведено збір і аналіз даних та їх узагальнення)