Анотація до роботи:

Мельничук М.Д. Молекулярно-біологічне вивчення геномних і реплікативних РНК фіто- та міковірусів як основа для створення рослинних біотехнологій. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальностями 03.00.06 - вірусологія та 03.00.20 - біотехнологія. Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, Київ, 2006.

Робота присвячена створенню і впровадженню в Україні системи вірусологічних біотехнологій для ідентифікації фітовірусів і міковірусів та оздоровлення рослин від інфекційних хвороб.

Вдосконалено методику, оптимізовано процедури і розроблено молекулярно-біологічні тест-системи для виділення, очистки й ідентифікації дволанцюгових вірусних РНК з рослин та грибів. За результатами електронно-мікроскопічних досліджень, клонування фрагментів длРНК та аналізу філогенетичних дерев, побудованих за вирівнюванням амінокислотних послідовностей фрагментів гена РНК-залежної РНК-полімерази, ідентифіковано новий міковірус Helicobasidium purpureum Рartitivirus.

Вперше визначено видовий склад мікроміцетів в листках, коренеплодах та ризосфері цукрових буряків, отримано чисті культури грибів, уражених вірусами. За нуклеотидними послідовностями внутрішніх трансляційних спейсерів рибосомальних генів визначено належність вірусінфікованих культур мікроміцетів до родів Peniofora, Thanatephorus, Schizophillum. З'ясовано причетність міковірусів до виникнення гнилей коренеплодів цукрових буряків, що викликаються мікроміцетами, і показано можливість оцінки шкодочинності мікопатогенів за наявністю в рослинах вірусних длРНК.

Важливі науково-технічні розробки дисертаційної роботи, зокрема спосіб діагностики та ідентифікації РНК-вмісних фітовірусів, клонального мікророзмноження ароматичних сортів хмелю та новий сорт хмелю «Національний» захищені патентами на винаходи та свідоцтвом про авторство на сорт рослин.

Впровадження розробок у виробництво та їх висока ефективність підтверджена 5 актами та 3 довідками.

1. Вперше вдосконалено і впроваджено в лабораторну практику методику виділення і очистки дволанцюгових вірусних РНК з рослин та грибів шляхом хроматографії в градієнті целюлози.

2. Оптимізовано процедури отримання дволанцюгових геномних РНК міковірусів і реплікативних РНК фітовірусів із рослин картоплі, перцю, хмелю та цукрових буряків.

3. Вперше в Україні на прикладі трансгенних сортів картоплі, стійких до колорадського жука, розроблено молекулярно-біологічну систему тестування генетично-модифікованих рослин шляхом ПЛР-ідентифікації 35S промотору вірусу мозаїки цвітної капусти та гена Cry IIIA.

4. Методом електронної мікроскопії, імуноферментного аналізу і ПЛР встановлено, що трансгенні сорти картоплі NL Russet Burbank, Superior та Atlantic значно уражуються X-, Y- та S- вірусами картоплі в польових умовах. Вірусна інфекція спричиняє надзвичайно високу чутливість бульб до кореневих гнилей та плісняви.

5. На основі РТ ПЛР розроблено молекулярно-біологічну систему ідентифікації вірусних РНК, за якою встановлено, що клоновані фрагменти дволанцюгових РНК, виділених із цукрових буряків, проявляють спорідненість до деяких генів фітовірусів і міковірусів.

6. За даними електронної мікроскопії, аналізу клонованих фрагментів длРНК та філогенетичних дерев, побудованих за вирівнюванням амінокислотних послідовностей фрагментів гена РНК-залежної РНК-полімерази, ідентифіковано новий міковірус Helicobasidium purpureum Рartitivirus.

7. Вперше отримано і зареєстровано в світових генетичних банках даних нуклеотидну та амінокислотну послідовності фрагмента гена РНК-залежної РНК-полімерази міковірусу Helicobasidium purpureum Рartitivirus (AY949837 та AAX53614), а також нуклеотидну послідовність фрагмента гена цитоплазматичних включень (CI) ізоляту потівірусу мозаїки буряків, виділеного в Україні.

8. Вперше визначено видовий склад мікроміцетів у листках, коренеплодах та ризосфері цукрових буряків і отримано чисті культури грибів, уражених вірусами.

9. Методом електронної мікроскопії ультратонких зрізів інфікованих грибних культур показано цитоплазматичну локалізацію вірусу Helicobasidium purpureum Рartitivirus і його негативний вплив на клітинну стінку та органоїди гриба.

10. За нуклеотидними послідовностями внутрішніх трансляційних спейсерів рибосомальних генів визначено належність вірусінфікованих культур базидіальних грибів до родів Peniofora, Thanatephorus, Schizophillum.

11. Встановлено високий рівень ураження деяких чистих культур мікроміцетів міковірусом Helicobasidium purpureum Рartitivirus. Концентрація вірусу в культурі Schizophillum sp., визначена методом ПЛР у реальному часі, становить 7, 33 х 10¹⁰ вірусних часток на 50 мг міцелію.

12. Вперше в Україні розроблено і впроваджено біотехнологію формування промислових плантацій хмелю на безвірусній основі, яка включає оздоровлення, добір, клонування та розмноження садивного матеріалу in vitro, а також адаптацію рослин до умов відкритого ґрунту.

13. Показано, що розроблена біотехнологія отримання саджанців хмелю значно переважає традиційну технологію прямого вегетативного живцювання за розвитком первинної кореневої системи рослин, ступенем їх стійкості до фітопатогенів, а також врожайністю і товарною якістю хмелевої шишки.

14. Шляхом селекційного добору клітин із сестринської форми сорту Слов'янка за критерієм високої стійкості до хімічних та фізичних факторів при оздоровленні рослин in vitro створено і зареєстровано в Україні новий сорт хмелю Національний.

Публікації автора:

1. Мельничук М.Д., Новак Т.В., Левенко Б.О. Основи біотехнології рослин. Посібник: – 2000, К.: Ей-Бі-Сі - 248с. (Здобувачем виконано біля третини роботи із залученням отриманих власноруч наукових результатів).

2. Мельничук М.Д., Кожукало В.Є, Смирнова С.О., Мартин Г.Г. Лабораторний практикум із загальної фітовірусології. – К:, НАУ, 2002 – 261с. (Здобувач автор 2-х розділів і відповідальний за редакцію та видання).

3. Мельничук М.Д., Новак Т.В., Кунах В.А. Біотехнологія рослин: Підручник. – К.:, ПоліграфКонсалтинг, 2003. - 520 с. (Дисертантом написано 7 із 19 розділів роботи).

4. Мельничук М.Д., Новак Т.В., Клюваденко А.А., Пінчук А.П. Практикум з біотехнології рослин. - К.: НАУ, 2005.–114 с. (Здобувачем підготовлено тему "Отримання безвірусних рослин in vitro" і здійснено загальну редакцію видання).

5. Мельничук М.Д. Фітовірусологія. Посібник. – К.: ПоліграфКонсалтинг, 2005. – 200с.

6. Мельничук М.Д. Проблема карлавірусної інфекції хмелю в Україні // Науковий вісник Національного аграрного університету. - 1998, №4. - С. 28 - 33.

7. Мельничук М.Д. Діагностика та ідентифікація РНК-вмісних вірусів рослин на стадії бінарних форм РНК при реплікації в клітині // Бюл. Ін-ту
   с.-г. мікробіол. - 2000, №8, - С. 13 - 15.

8. Мельничук М.Д. Реакция сверхчувствительности растений при инфицировании фитовирусами // Бюл. Ін-ту с.-г. мікробіол. – 2000. - №6. - С. 25-28.

9. Мельничук М.Д. Біологічні основи по отриманню та використанню трансгенних рослин стійких до вірусних патогенів // Аграрна наука та освіта. – 2000. - №1. - С. 36 - 42.

10. Мельничук М.Д. Ідентифікація моно- та змішаних вірозів цукрового буряку (Beta vulgaris L.) // Науковий вісник Національного аграрного університету. - 2002. – №40. – С. 23 – 27.

11. Мельничук М.Д., Смирнова С.О., Кожукало В.Є. Діагностика та ідентифікація вірусів хмелю (Humulus lupulus L.) новітньої української селекції // Бюл. Ін-ту с.-г. мікробіол. – 2000. - №7. -С. 37-38. (Здобувачем здійснено пошук, узагальнено дані, проведено первинне виділення та обговорення результатів).

12. Мельничук М.Д., Клюваденко А.А. Давиденко О.А. Отримання безвірусного посадкового матеріалу хмелю (Humulus lupulus L.) в умовах in vitro // Науковий вісник Національного аграрного університету. - 2000. - №29. - С. 47 - 52. (Здобувачем здійснено керівництво роботою, контролювання фітогормонального складу середовища, оптимізовано технологію адаптації рослин до умов in vivo, підготовлено матеріали до публікації).

13. Мельничук М.Д., Валверді Р.А. Діагностика та ідентифікація РНК-вмісних фітовірусів на стадії їх біосинтезу шляхом вивчення фізико-хімічних властивостей вірусних дволанцюгових РНК // Доп. НАН України. – 2001.- № 3. - С. 175 - 179. (Дисертантом виконано планування експерименту, методичну роботу, проведено обговорення результатів і підготовку публікації до друку, окрім графічних схем та відбору зразків, які виконано із співавтором).

14. Мельничук М.Д., Спиридонов В.Г., Стеценко В.С. Фітовіруси на трансгенній картоплі. Діагностика та ідентифікація на сортах стійких щодо колорадського жука // Захист рослин. – 2001.- №8. - С 32. (Здобувачем проведено відбір інфікованих зразків, діагностику рослин, виділення длРНК, обговорення результатів та підготовку публікації до друку).

15. Мельничук М.Д., Кожукало В.Є., Оверченко В.В., Смирнова С.О. Методичні підходи по виділенню та очистці карлавірусу хмелю на плантаціях світової колекції в Україні // Аграрна наука та освіта. – 2001. – 2, № 1. – С. 5 – 10. (Здобувачем проведено планування досліду, виділення вірусу, обговорення результатів та підготовлено публікацію до друку спільно із співавторами).

16. Мельничук М.Д., Спиридонов В.Г. Аналіз гена капсидного білка вірусу мозаїки люцерни (CP AlMV), клонованого у вектор для трансформації рослин pBI 121 // Мікробіол. журн. – 2001.- 63, №4. - С. 62 – 69. (Дисертантом сплановано і частково проведено методичні роботи з біотехнологічних маніпуляцій із ізольованими генами).

17. Мельничук М.Д., Спиридонов В.Г. Ідентифікація фітовірусів, що інфікують трансгенну картоплю, стійку до колорадського жука // Мікробіол. журн. – 2002. – 63, №6. – С. 53 – 60. (Здобувачем проведено відбір інфікованих зразків, виділення длРНК, опрацьовано і розроблено у співавторстві модифікацію ІФА, впроваджено метод діагностики шляхом виділення длРНК із інфікованих рослин картоплі, здійснено обговорення результатів та підготовлено публікацію до друку).

18. Мельничук М.Д., Дубін А.В., Спиридонов В.Г., Мельничук С.Д. Детекція та ідентифікація трансгенів у генетично-модифікованих рослинах на прикладі Bt-картоплі // Мікробіол. журн. – 2002. – 64, №3. – С. 26 – 32. (Здобувачем відібрано інфіковані і контрольні рослинні зразки, виділено длРНК, розроблено у співавторстві тест-систему на виявлення трансгену CryIIIA та 35S промотору, проведено обговорення результатів та підготовку публікації до друку).

19. Мельничук М.Д., Дьячкова О.О., Смирнова С.О. Морфофізіологічні та біохімічні зміни рослин перцю (Capsicum anuum L.) при інфікуванні вірусом тютюнової мозаїки // Науковий вісник Національного аграрного університету. - 2002. – №50. – С. 13 – 18. (Здобувачем проведено планування експерименту, експериментальне вирощування інокульованих рослин, діагностику вірусоносійства шляхом виділення длРНК ВТМ із інфікованих рослин перцю).

20. Мельничук М.Д., Оверченко В.В., Бойко О.А., Бойко А.Л. Карлавіруси в агроценозах // Захист рослин. – 2002. - №11. – С. 13. (Здобувачем проведено відбір інфікованих зразків хмелю, виділено карлавірус хмелю та підготовлено публікацію до друку).

21. Мельничук М.Д., Кожукало В.Е., Дьячкова О.А., Сытник С.К., Алексеенко И.П., Смирнова С.А. Влияние вируса табачной мозаики на ультраструктуру клеток мезофилла листа перца Capsicum annum L. // Мікробіол. журн. - 2002. – 64, № 6. – С. 35 – 40. (Дисертантом проведено електронно-мікроскопічний аналіз вірусу тютюнової мозаїки із інфікованих рослин перцю, обговорення та інтерпретацію результатів до друку).

22. Мельничук М.Д., Дьячкова О.О., Смирнова С.О., Олексієнко І.П. Зміни активності пероксидази рослин перцю та тютюну інфікованих вірусом тютюнової мозаїки // Физиология и биохимия культ. растений. – 2003. – 35, №1. – С.43 – 47. (Здобувачем заплановано експеримент, проведено аналіз та обговорення результатів).

23. Мельничук М.Д., Дубин А.В., Сытник С.К. Идентификация и определение локализации вирусной РНК в хлоропластах перца (Capsicum annum L.) методом полимеразной цепной реакции // Мікробіол. журн. – 2003. – 65, № 3. – С. 54 – 59. (Дисертантом розроблено методику ідентифікації РНК методом РТ ПЛР і проведено узагальнення результатів).

24. Мельничук М.Д., Оверченко В.В., Дубін О.В. Діагностика латентного вірусу хмелю на сортах української селекції // Мікробіол. журн. – 2003. – 65, № 4. – С. 43 – 50. (Здобувачем проведено виділення длРНК карлавірусу хмелю, розроблено діагностикум на вірусоносійство шляхом виділення длРНК із експериментально інфікованих індикаторних рослин та обговорення результатів).

25. Мельничук М.Д., Клюваденко А.А., Михайличенко К.П. Технологія отримання морфогенного калуса хмелю (Humulus lupulus L.) гірких сортів на безвірусній основі в умовах in vitro // Аграрна наука та освіта. – 2003. - 4, №3 – 4. – С.15– 21. (Здобувачем розроблено загальну схему дослідження, оптимізовано склад живильних середовищ, здійснено узагальнення результатів до друку).

26. Мельничук М.Д., Дубін О.В. Тестування та оптимізація умов проведення ISSR-PCR при аналізі геному хмелю (Humulus lupulus L.). // Науковий вісник Національного аграрного університету. - 2004. – №73. – С. 17 – 21. (Дисертантом розроблено загальну схему дослідження, оптимізовано умови та параметри генетичного аналізу геному хмелю біотехнологічними підходами).

27. Мельничук М.Д., Дубін О.В., Дьячкова О.О., Кожукало В.Є. ISSR-PCR та RAPD в оцінці молекулярно-генетичного поліморфізму сортів хмелю (Humulus lupulus L.) // Науковий вісник Національного аграрного університету. - 2004. – №77. – С. 47 – 54. (Здобувачем сплановано експеримент, проведено аналіз результатів дослідження, оптимізовано умови та параметри електрофорезу фрагментів кДНК).

28. Мельничук М.Д., Спиридонов В.Г., Смирнова С.О. Ідентифікація вірусних дволанцюгових РНК, виділених з цукрових буряків (Beta vulgaris) // Доп. НАН України. – 2004. – №5, – С. 174-180. (Здобувачем проведено планування експерименту, складено загальну схему дослідження, біотехнологічними підходами розроблено стратегію подальшого вивчення неописаного раніше вірусу).

29. Мельничук М.Д., Сивик А.Є. Генетичні модифікації рослин. Методи виявлення у світовій практиці // Захист рослин. - 2004. – 6. - С. 8 – 11. (Дисертантом сплановано дослідження і подано логічний підхід з стратегії ідентифікації ГМО в лабораторних дослідженнях).

30. Мельничук М.Д., Заграфова М.Й., Клюваденко А.А. та ін. Біологічні технології та економічна ефективність створення маточників хмелю для промислових плантацій // Аграрна наука та освіта. – 2004. – 5, № 3-4. – С. 20-25. (Здобувачем проведено відбір інфікованих зразків хмелю, комплекс вірусолого-біотехнологічних робіт з оздоровлення від фітопатогенів та клонального мікророзмноження згідно власної запатентованої технології, аналіз результатів та редагування публікації).

31. Мельничук М.Д., Спиридонов В.Г. Филогенетический анализ частичной последовательности вирусной РНК-зависимой РНК полимеразы, кодируемой двухцепочечными РНК элементами из сахарной свеклы (Beta vulgaris) // Доп. НАН України. 2004. – № 9. – С. 167-171. (Здобувачем вперше проведено повний генетичний аналіз вірусного фермента, ідентифіковано геном нового вірусу шляхом запропонованої власно модифікованої методики виділення длРНК, підготовлено до друку публікацію).

32. Мельничук М.Д., Спиридонов В.Г. Молекулярная идентичность двухцепочечных РНК-элементов вирусной природы, выделенных из сахарной свеклы // Мікробіол. журн. – 2005. – 67, № 2.– С. 55–62. (Здобувачем проведено моніторингові дослідження по розповсюдженню міковірусу із цукрових буряків в різних регіонах України, виділення і ідентифікацію фрагментів длРНК, їх клонування, селекцію клонів, сиквенування, ідентифіковано новий міковірус та підготовлено до друку публікацію).

33. Мельничук М.Д., Зубова Т.Н., Смирнова С.О., Спиридонов В.Г. Видовий склад мікроміцетів листя, коренеплодів і ризосфери цукрового буряка // Мікробіол. журн. - 2005. – 67, №3.– С. 44-50. (Здобувачем проведено роботи з оптимізації живильних середовищ по культивуванню мікокультур виділених із цукрових буряків, розроблено біотехнологію культивування інфікованих міковірусами грибів в умовах in vitro).

34. Мельничук М.Д., Спиридонов В.Г., Олексієнко І.П. Особливості вірусних дволанцюгових РНК, виділених з мікроскопічних грибів, що паразитують на цукрових буряках // Мікробіол. журн. – 2005. – 67, №4. – С. 52 – 58. (Здобувачем проведено експеримент з виділення длРНК із мікокультур з цукрових буряків, пророблено мікроскопічний аналіз мікокультур і нативного міковірусу, розроблено біотехнологію культивування та зберігання інфікованих міковірусами грибів, підготовлено публікацію до друку).

35. Мельничук М.Д., Спиридонов В.Г. Біонебезпека трансгенних технологій з використанням 35S промотору // Генетично модифіковані рослини: перспективи та проблеми. Зб. доп. наук. конф. Інститут цукрових буряків УААН, - 2002. - С. 83 – 88. (Дисертантом складено літературний огляд із даної проблеми, обговорено результати з ідентифікації 35S промотору трансгенних рослин із рослин Bt-картоплі та підготовлено публікацію до друку).

36. Ібатуллін І.І., Городній М.М., Кривенок М.Я., Дубровін В.О., Ільчук М.М., Мельничук М.Д., Мельничук С.Д., Пасічник Н.А., Строчинський А.А., Угнівенко А.М., Хмельницький Г.О. Наукове забезпечення сталого розвитку сільського господарства в Поліссі України. Монографія в 2-х томах. Кабінет Міністрів України, НАУ, К.: Вид-во ТОВ "Алефа", 2004.т.1 – С. 446 – 455. (Здобувачем підготовлено главу монографії в розрізі біотехнології в хмелярстві, здійснено загальне редагування видання).

37. Ібатуллін І.І., Городній М.М., Кривенок М.Я., Дубровін В.О., Ільчук М.М., Мельничук М.Д., Мельничук С.Д., Пасічник Н.А., Строчинський А.А., Угнівенко А.М., Хмельницький Г.О. Наукове забезпечення сталого розвитку сільського господарства в лісостепу України. Монографія в 2-х томах. Кабінет Міністрів України, НАУ – К.: Вид-во ТОВ "Алефа", 2003. т.2 – С. 645 - 650. (Здобувачем підготовлено практичні матеріали із власних досліджень в розрізі фітовірусології та біотехнології рослин, здійснено загальне редагування видання).

38. Пат. України на винахід №59131/7 А01Н4/00 // Спосіб клонального мікророзмноження хмелю (Humulus lupulus L.) ароматичних сортів. Мельничук М.Д. - Опубл. 15.05.2005, Бюл. № 5.

39. Пат. України на винахід №55096/7 С12Q1/68 // Спосіб діагностики та ідентифікації РНК-вмісних фітовірусів. Мельничук М.Д. - Опубл. 16.08.2004, Бюл. № 8.

40. Мельничук М.Д., Новак Т.В., Пінчук А.П., Клюваденко А.А. Методичні рекомендації для мікроклонального розмноження деревних та трав’янистих рослин. – К.:НАУ, 2004. - 37с.

41. Kripkyy O.E., Melnychuk M.D., Kripkyy Ol.E. Developing of methods for obtaining embriogenic callus and protoplasts from hops (Humulus lupulus L.). II International Symposium on Plant Biotechnology. (4 – 8 October, Kiev, Ukraine). – 1998. – P.67.

42. Мельничук М.Д., Мартин Г.Г., Смирнова С.О. Мікроскопічне дослідження карлавіруса виділеного з рослин хмелю в умовах України //
    Тез. доп. між нар. конф. “Біологічні ресурси та віруси” (Київ, 7 –10 вересня), Київ - 1998. - С. 92.

43. Melnychuk M.D., Martyn G.G., Smyrnova S.O., Kozhukalo V.E., Koshevski I.I. In vitro obtaining and microscopy investigations virus-free hop (Humulus lupulus L.). International Hop Growers Convention. (27 – 30 July, Pulawy, Poland).– 1999. – Р.136

44. Melnychuk M.D., Martyn G.G., Klyuvadenko A.A., Davidenko O.A. Obtaining of the virus-free hops (Humulus lupulus L.) seedlings from the apical morphogenic callus. Biologia, 54 Suppl. 7, 1999. – Р.72

45. Melnychuk M., Klyuvadenko A., Davydenko O., Spyrydonov V. Direct and indirect in vitro morphogenesis of the hop (Humulus lupulus) // 37^th Croatian symposium on agriculture with an International Participation. (Opatija, February 19 – 23). – 2001. – Р.252.

46. Мельничук М.Д., Давиденко О.А., Клюваденко А.А. Морфогенез та розмноження рослин хмелю (Humulus lupulus L.) на безвірусній основі в умовах in vitro // Тез. доп. ІІІ Міжнародної конф. “Біологічні ресурси та віруси”. (Київ, 11 –15 вересня). – Київ:2001. - С. 85.

47. Melnychuk M.D. Pathological interactions of the hop (Humulus lupulus L.) Carlavirus with cells and organoids membranes // Междунар. конф. молодых учених, посвященной 185 – летию Харьковского государственного аграрного университета им. В.В. Докучаева. (Харьков, 26 – 28 сентября). – Харьков:2001. - С. 59 – 60.

48. Melnychuk M.D., Dyachkova O.O, Smirnova S.O. Some reciprocal morphophisiological and biochemical reactions of plants at biological stress under virus infection // Abstracs Internat.Symp. "Plant under Environmental Stress" (Moscow, K.A. Timiryazev Institute of Plant Physiology, October 23 –28, 2001). Moscow: Publishing Houses of Peoples Friendship University of Russia. – 2001. – P.187-188.

49. Мельничук М.Д., Вознюк С.І., Мельничук А.В. Біологічні технології на шляху підняття ефективності, якості та безпеки сировини хмелю в Україні // Тез. доп. ІІІ Між нар. науково-практичної конф. “Актуальні питання гігієни харчування та безпечності харчових продуктів: збагачення раціону харчування: медичні проблеми, практичні рішення” (Київ, 13-14 травня
    2004 р.). – Київ: 2004. – С.6.

50. Мельничук М.Д. Клонування рослин як спосіб підвищення сільськогосподарського виробництва // Сільське господарство: наука і практика: Матеріали V симпозіуму Україна-Австрія (Київ, 9-11 вересня 2004р.). – К.: ЗАТ “Ніч лава”, 2004. – С. 153-154.