Анотація до роботи:

Довбешко Г.І. "Молекулярні механізми взаємодії біомолекул з наноструктурами, лігандами та малими дозами мікрохвильового та радіаційного випромінювання". - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора фізико-математичних наук за спеціальністю 03.00.02 - біофізика. - Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна, Харків, 2009.

Дисертацію присвячено дослідженню молекулярних механізмів взаємодії біомолекул з металічними та вуглецевими наноструктурами, протипухлинними препаратами та малими дозами іонізуючого та мікрохвильового випромінювання. Запропоновано та застосовано нову методику підсиленого інфрачервоного поглинання молекул поблизу наноструктурованих металічних поверхонь (SEIRA) для детектування малих кількостей біомолекул та визначення конформаційних станів ДНК та білків. Застосування розроблених нами наноструктурованих золотих поверхонь допомогло виявити особливості структурної організації нуклеїнових кислот, екстрагованих з пухлин різного ступеня злоякісності, а також резистентних та чутливих штамів до та після дії протипухлинних препаратів in vivo та in vitro.

Виявлено, що молекулярний механізм дії малих доз (1-57 сГр) радіаційного опромінення на тварини полягає в ушкодженні первинної та вторинної структури ДНК. Дослідження дії слабких доз (1-100 мВт/см²) мікрохвильового випромінювання в діапазоні 37-78 ГГц на оптичні та поляризаційні властивості модельних біологічних структур вказує на поляризаційний механізм дії мікрохвиль.

Визначено конформаційні стани, можливі місця зв'язування та енергетичні характеристики ДНК та білків, адсорбованих на вуглецевих одностінних нанотрубках та металічних наноструктурах.

У роботі отримано нові результати щодо молекулярних механізмів взаємодії ДНК та альбуміну з колоїдними частинками та шорсткою поверхнею золота, а також ДНК, аденіну, тиміну, альбуміну з вуглецевими нанотрубками. З використанням нових підходів на основі методу SEIRA поглиблено розуміння молекулярних механізмів впливу малих доз іонізуючого і мікрохвильового випромінювання на модельні біологічні системи та резистентності до дії ліків. За підсумками роботи сформульовано низку основних наукових висновків:

1. На основі ефекту SEIRA розроблено методику детектування малих кількостей біологічних молекул та їхніх моношарів. На прикладі молекул БСА та ДНК показано, що шорстка поверхня плівки золота не впливає на конформацію біомакромолекул. Водночас, частинки колоїдного золота індукують конформаційні перетворення окремих фрагментів ДНК в А- та Z-форми.

2. Вперше проведено систематичне дослідження впливу низки факторів, а саме – типу металу та топології поверхні, способів осадження, структури молекул – на підсилення інтенсивності ІЧ-поглинання біологічних молекул (гуаніну, гліцину, БСА, ДНК), адсорбованих на наноструктуровану поверхню металу. Визначено умови виготовлення металічних поверхонь і способи осадження молекул, які гарантують максимальне підсилення сигналу в ІЧ спектрах. Максимальне підсилення демонструють плівки золота товщиною 200-300 Е з середньою висотою шорсткості 20-50 Е та діаметром 200-900 Е. Зареєстровано підсилення у 10 разів для багатошарових плівок різних біомолекул і підсилення у 100 разів для моношарів БСА.

3. Розроблено алгоритм визначення конформаційного стану ДНК на основі методу SEIRA та методу головних компонент. Запропонована методика ідентифікації структурних пошкоджень в НК на основі фур'є- ІЧ спектроскопії та нейронних мереж.

4. Встановлено, що молекулярний механізм дії малих доз (1-57 сГр) радіаційного опромінення на тварини, що перебували в Чорнобильській зоні на протязі від 4 до 12 місяців, полягає в ушкодженні первинної та вторинної структури ДНК. На це вказують перебудова сітки водневих зв'язків та можлива зміна типу спарювання основ, спричинених модифікацією основ та цукрових залишків і, як наслідок, розупорядкування структури.

5. Виявлено суттєві відмінності в просторовій організації макромолекули ДНК з тканин чутливих та резистентних штамів пухлин, зумовлені впливом протипухлинних препаратів цис-платини та доксорубіцину. Структуру ДНК з резистентних пухлин можна охарактеризувати більшим рівнем впорядкованості, вона є жорсткішою, за спектральними ознаками ближча до канонічної спіральної структури і менше змінюється під дією зовнішніх чинників. Структура ДНК з чутливих штамів пухлин є більш гнучкою, характеризується вищим рівнем розупорядкування та наявністю неканонічних конформаційних станів.

6. Показано, що дія протипухлинних препаратів на чутливий штам пухлинних тканин викликає сильніші зміни спектральних параметрів ДНК, порівняно з резистентним. В той же час, застосування цис-платини до пухлинних тканин викликає менш яскраві зміни в ІЧ-спектрах ДНК порівняно з дією доксорубіцину: це може бути пов'язано з частковою затримкою цис-платини плазматичними мембранами пухлинних клітин. Лікування чутливих пухлин доксорубіцином призводить до стабілізації структури ДНК, що проявляється як в зменшенні кількості розділених смуг поглинання, так і в перерозподілі їхніх інтенсивностей. У ДНК з резистентних пухлин після дії препаратів, навпаки, спостерігається зростання розупорядкування.

7. Визначено спектроскопічні параметри, якими можна охарактеризувати НК з пухлинних тканин поява більшої кількості розділених смуг поглинання, порівняно зі спектром контролю; поява неканонічних форм цукрових залишків, зростанням вкладу поглинання в області 1070 см^-1, зміна параметрів смуг фосфатів, в тому числі, суттєве в 1,3 - 2 рази зменшення, порівняно з контролем інтегральної інтенсивності антисиметричних коливань РО₂^-; перерозподіл внесків ОН та NH водневозв'язаних молекулярних груп; зростання інтегральної інтенсивності валентних коливань груп СН; в РНК виділення в окрему компоненту коливань С-О молекулярної групи в області 1150 см^-1. Всі ці ознаки свідчать про розупорядкування в структурі ДНК з пухлин порівняно з контролем.

8. На базі проведених експериментів в умовах in vivo запропонована модель взаємодії лігандів з клітиною, яка враховує не тільки вплив ліганда на мішень, а й зворотній вплив мішені на ліганд і включає: взаємодію ліганда з мембраною, ДНК, білками; модифікацію мембрани, ДНК та інших фрагментів клітини в результаті такої взаємодії; модифікацію ліганда при проходженні через мембрану та при взаємодіях у клітині.

9. Експериментально та теоретично показано, що під впливом окремих частот мікрохвильового поля в діапазоні 37-78 ГГц і потужністю до 100 мВт/cм² змінюється показник заломлення альбуміну та плазми крові; коефіцієнт відбивання поляризованого ІЧ світла, коефіцієнти тензора діелектричної проникності і нелінійна поляризовність кристалів амінокислот a-гліцину, в-аланіну, і гліцин-вмісного монокристалу - тригліцинсульфату. Виходячи зі зміни поляризовності і дипольних моментів як окремих молекулярних груп, так і молекул у цілому, запропоновано поляризаційну модель дії мікрохвильового поля на біологічні молекули.

10. На основі створеної технології отримання прозорих розчинів вугле-цевих одностінних нанотрубок, розділених за допомогою ДНК, отримано їх комплекси з нанотрубками. Показано, що в таких комплексах ДНК знаходиться в неканонічному конформаційному стані та визначено місця зв'язування нанотрубок з ДНК. Розраховано енергії зв'язування основ ДНК-тиміну та аденіну - з нанотрубками. Показано, що Ван-дер-Ваальсові взаємодії лежать в основі утворення стабільних комплексів ДНК-нанотрубка з енергіями 3,2-12,1 кКал/моль. Ця система є перспективною для доставки ліків до пухлин.

11. Показано, що міжмолекулярна взаємодія вуглецевих нанотрубок з альбуміном призводить до змін в конформаційному складі білка: збільшується кількість невпорядкованої фази та поворотів, зменшується вміст основної фази та води, при цьому альбумін залишається у вихідній основній формі, а саме, в a-спіралі.

Публікації автора:

1. Belokur Ye.L. Modelling and calculation of infrared spectra of complex biological molecules / Belokur Ye.L., Dovbeshko G.I., Litvinov G.S. // J. Mol. Structure. - 1992. - Vol. 267. - P. 61-66. 2. Bизyaлизaция дeйcтвия миллиметрового излучения на плазму крови / Бережинский Л.И., Гpидина Н.Я., Довбешко Г.И., Лисица М.П., Литвинов Г.С. // Биофизика. -1993. -Vol.38, №2. -С.378-384.

3. Перестройки в поляризованных колебательных спектрах глицинсодержащих кристаллов под действием миллиметрового излучения / Бережинский Л.И., Довбешко Г.И., Литвинов Г. С., Обуховский В.В., Яновская Н.Б. // Оптика и спектроскопия. -1993. -Vol.75, №3. -P.628 - 636.

4. Dovbeshko G.I. Low-frequency vibrational spectra of some amino acids/ Dovbeshko G.I., Berezhinsky L.I.// J.Mol.Structure. -1998. -Vol.450, -P.121-128.

5. Vibrational spectra of crystalline b-Ala / Dovbeshko G.I., Berezhinsky L.I., Lisitsa M.P., Litvinov G.S. // Spectrochimica Acta A. -1998. -Vol.54. -P.349-358.

6. Исследование структурных повреждений в молекулах ДНК из гамма-облучённых крыс / Круглова Е.Б., Довбешко Г.И., Крутько Н.А., Пащук Е.П., Карпенко Н.А., Алесина М.Ю., Красницкая А.А. // Вісник Харківського Університету. Біофізичний Вісник. - 1999. - Т. 450, № 4. - С. 92 - 95.

7. Довбешко Г.І. Особливості інфрачервоних спектрів нуклеїнових кислот з пухлинних тканин / Довбешко Г.І., Гридіна Н.Я. // Вісник Харківського Університету. Біофізичний Вісник. - 1999. - Т. 450, №4. -С. 85 - 87.

8. FTIR spectroscopy studies of nucleic acid damage / Dovbeshko G.I., Gridina N.Ya., Kruglova E.B., Paschuk O.P. // Talanta. - 2000. - Vol. 53. - P. 233 - 246.

9. Electron and vibrational spectra of b-ala single crystal: new data from ESCA, Raman and FTIR spectroscopy / Dovbeshko G.I., Berezhinsky L.I., Talik E., Woznjak R., Zawada K., Bukovska I. // Functional materials. - 2000. -Vol.7,№ 4. -P.722-725

10. FTIR spectroscopy studies of DNA from low-dose irradiated tissue / Dovbeshko G.I., Kruglova E.B., Repnytska O.P., Alesina M., Karpenko N.Ya., Mysnyk A., Novoselets M. // Biophysical Bulletin. Visnyk Kharkivskogo universytetu.-2000. -Vol. 497, № 2(7). -P. 65-73.

11. Berezhinsky L.I. Microwave-induced optical non-lineary of amino acid crystals / Berezhinsky L.I., Dovbeshko G.I., Obukhovsky V.V. // Semiconductor Physics, Quantum Electronics and Optoelectronics. - 2001. - Vol.4, №4. - P.331-336.

12. О диелектрической проницаемости b-аланина в миллиметровом диапазоне / Макеев Ю.Г., Моторненко А.П., Ермак Г.П., Довбешко Г.И. // Вісник Харківського національного університету. Біофізичний бюлетень. - 2001. - Vol. №528, № 2(9). -С. 100-102.

13. Surface plasmon resonance of adsorbed molecules of proteins under microwave fields / Berezhinsky L.I., Dovbeshko G.I., Chegel V.I., Shirshov Yu.M., Melnichuk A., // Semiconductor Physics, Quantum Electronics and Optoelectronics. - 2001. - Vol.4, N4. - P. 333 - 336.

14. Surface enhanced infrared absorption of nucleic acids on gold substrate / Dovbeshko G.I., Chegel V.I., Gridina N.Ya., Repnytska O.P., Shirshov Y.M., Tryndiak V.P., Todor I.M. // Semiconductor Physics, Quantum Electronics and Optoelectronics. - 2001. - Vol.4, №3. - P. 202-206.

15. The possible role of biffurcated hydrogen bonds in formation of low- frequency spectra of amino acids / Berezhynskiy L.Y., Dovbeshko G.I., Sekirin I.V., Repnytska O.P. // Ukrainian Physical Journal. - 2001. -V46, №5-6. -P.541 -545.

16. Surface enhanced infrared absorption of nucleic acids from tumour cells: an FTIR reflectance study / Dovbeshko G.I., Chegel V.I., Gridina N.Ya., Repnytska O.P., Shirshov Y.M., Tryndiak V.P., Todor I.M., Solyanik G.I. // Biospectroscopy, USA. - 2002. - Vol.67. - P. 470-486.

17. FTIR reflectance and UV-VIS study of two-water-colloidal solution of C60 fullerene / Andrievsky G.V., Bordyuh A., Dovbeshko G.I., Klochkov V.K. // Chemical Physics Letters. – 2002. – Vol. 364. – P. 8–17.

18. The SEIRA spectroscopy data of nucleic acids and phospholipids from sensitive- and drug-resistant rat tumours / Chekhun V. F., Solyanik G. I., Kulik G.I., Tryndiak V.P., Todor I.N., Dovbeshko G.I., Repnytska O.P. // Journal of Experimental Clinical Cancer Research. – 2002. – Vol.21, №4. – P.599-607.

19. Interaction of nucleic acids and lipids from tumour cells with anticancer drugs: an SEIRA spectroscopy data / Dovbeshko G.I., Repnytska O.P., Tryndyak V.P., Todor I.M., Solyanik G.I., Chehun V.F. // Frontiers of Multifunctional Nanosystems, Eds.: E.Buzaneva, P.Scharff., Amsterdam: Kluwer Academic Piblishers. –2002. –P. 265–280.

20. Structure transition in lipids and nucleic acids of tumour cells under anti-cancer drugs application / Dovbeshko G.I., Repnytska O.P., Tryndiak V.P., Todor I.M. // Proceedings of SPIE. –2003. –Vol. 5257. –P. 320–328.

21. DNA interaction with single-walled carbon nanotubes: a SEIRA study / Dovbeshko G.I., Repnytska O.P., Obraztsova E.D., Shtogun Y.V. // Chemical Physics Letters. – 2003. – Vol. 372. – P.432 – 437.

22. Study of DNA interaction with carbon nanotubes / Dovbeshko G.I., Repnytska O. P., Obraztsova E. D., Shtogun Y.V., Andreev E.O. // Semiconductor Physics, Quantum Electronics and Optoelectronics. – 2003. – V.6, №1. – P.105–108.

23. Dovbeshko G.I. Role of low-frequency modes in the formation of dielectric function of b-alanine molecular crystal / Dovbeshko G.I., Grydyakina O.V., Romanyuk V.R. // Ukrainian Journal of Physical Optics. – 2003. – Vol.4, N1. – P.27–37.

24. Structural organisation of nucleic acids from tumour cells / Repnytska O.P., Dovbeshko G.I., Tryndiak V.P., Todor I.M. and Kosenkov D.V. // Faraday Discuss. – 2004. – Vol.126. – P.61 – 76.

25. Vibrational spectroscopy and principal component analysis for conformational study of virus nucleic acids / Dovbeshko G.I., Repnytska O., Pererva T., Miruta A., Kosenkov D. // Proceedings of SPIE. – 2004. – Vol. 5507. – P. 309–316.

26. Biological molecule conformations probed and enhanced by metal and carbon nanostructures: SEIRA, AFM and SPR data / Dovbeshko G., Chegel V.I., Paschuk O.P., Shirshov Yu.M, Nazarova A., Kosenkov D., Fesenko O. // Frontiers of Multifunctional Integrated Nanosystems; eds.: E. Buzaneva, P. Scharff. - Kluwer Academic Publishers, 2004. - P.447-466.

27. Спектроскопічні дослідження взаємодії ДНК з флуореновими барвниками / Пржонська В., Бондар М.В., Довбешко Г.І., Репницька О.П., Триндяк В.П., Тодор І.М., Белфілд К.Д. // Укр. фіз. журнал. – 2004. – T.49, № 7. – C. 636 – 647.

28. Gold and Colloidal Gold Surface Influence on DNA Conformational Changes / Dovbeshko G.I., Gnatyuk O.P., Chegel V.I., Shirshov Y.M., Kosenkov D.V., Andreev E.A., Tajmir-Riahi H.A., Litvin P. // Semiconductor Physics, Quantum Electronics & Optoelectronics. – 2004. – Vol.7, №3. – P.318 – 325.

29. Synthesis of carbon nanotubes from chlorine-containing precursor and their properties / Brichka S.Ya., Prikhod’ko G.P., Sementsov Yu.I., Brichka A.V., Paschuk O.P., Dovbeshko G.I. // Carbon. – 2004. – Vol.42. – P.2581–2587.

30. The enhancement of optical processes near rough surface of metals / Dovbeshko G.I., Fesenko O.M., Shirshov Yu.M., Chegel V.I. // Semiconductor, Quantum Electronics and Optoelectronics. – 2004. – Vol. 7, №4. – P. 411–424.

31. Vibrational spectra of carbonaceous materials: a SEIRA spectroscopy versus FTIR and Raman / Dovbeshko G.I., Gnatyuk O.P., Nazarova A.A., Sementsov Yu.I., Obraztsova E.D. // Fullerenes, Nanotubes and carbon nanostructures. –2005. –Vol.13, № 1. – P.393–400.

32. Effect of nanostructured gold surface on the SEIRA spectra of nucleic acid, Albumin, a-Glycine and Guanine / Dovbeshko G., Fesenko O., Chegel V., Shirshov Yu., Kosenkov D., Nazarova A. // Asian Chemistry Letter. – 2006. – Vol. 10, № 1 – 2. – P. 33 – 44.

33. Реактивність одностіних вуглецевих нанотрубок при взаємодії з біологічними макромолекулами – ДНК і білками. / Довбешко Г.І., Образцова О.Д., Фесенко О.М., Яковкін К.І. // Sensor Electronics and Microsystem Technologies. – 2006. – Vol. 1. – P.36 – 46.

34. Dovbeshko G. Effect of nanostructured metal surface on SEIRA spectra of albumin and nucleic acids / Dovbeshko G., Fesenko O., Nazarova A. // Journal of Physical Studies. –2006. – Vol. 10, №2. – P. 127 – 134.

35. Shtogun Ya.V. Adsorption of Adenine and Thymine and Their Radicals on Single-Wall Carbon Nanotubes / Shtogun Ya.V., Woods L. M., Dovbeshko G.I.// J. Phys. Chem. C. -2007. -Vol. 111. -P. 18174-18181.