Анотація до роботи:

Зубов П.М. Модифікація білків мембрано-цитоскелетного комплексу та ліпідної асиметрії в еритроцитах при охолодженні та заморожуванні у присутності кріопротектора ПЕО-1500.- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.19 – кріобіологія.- Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків, 2008.

Дисертаційна робота присвячена вивченню білок-білкових взаємодій у мембрано-цитоскелетному комплексі еритроцитів донорської та кордової крові, а також оцінці особливостей трансмембранного розподілу фосфатидилсерина в мембрані, що викликані впливом непроникаючого кріопротектора ПЕО-1500 та кріоконсервуванням. Встановлено, що обробка кріопротектором ПЕО-1500 призводить до посилення взаємодій в мембрано-цитоскелетному комплексі, зокрема вертикальних зв’язків цитоскелета та плазматичної мембрани, що опосередковані анкірином, б.с.4.1, б.с.4.2, а також укріплення зв’язків у структурі актинових протофіламентів за участі б.с.4.9. Кріоконсервування еритроцитів донорської та кордової крові викликає додаткові модифікації білок-білкових взаємодій, що призводить до зміни відносного вмісту білків. Ці модифікації залежать від температури інкубації з кріопротектором: обробка при 0-4⁰С, у порівнянні з 37⁰С, сприяє кращій збереженості білків. Встановлено, що зміни в мембрано-цитоскелетному комплексі еритроцитів донорської та кордової крові є зворотними при перенесенні клітин до фізіологічних умов. Показано, що клітини, оброблені ПЕО-1500 при 0-4⁰С, є більш стійкими до дії неіонного детергенту Тритон Х-100. Екстракція тіней еритроцитів кордової крові в Тритон Х-100 виявила збереженість у еритроцитів кордової крові б.с.3, який відсутній у еритроцитів донорської крові.

Виявлено високу стійкість глікофорина А до факторів низькотемпературного консервування: обробка еритроцитів ПЕО-1500 не призводить до зниження ступеня зв'язування глікофорина А з моноклональним антитілом Anti-glicophorin A РЕ, як на етапі інкубації з кріопротектором, так і після заморожування-відігрівання. Встановлена кореляція між відсотком анексин мічених клітин відразу після розморожування та рівнем гемолізу еритроцитів після перенесення їх до фізіологічних умов. При цьому як у еритроцитів донорської, так і кордової крові, оброблених ПЕО-1500 при 0-4⁰С, порушення асиметрії менше, ніж у клітин, оброблених при 37⁰С, що корелює з більш низьким рівнем гемолізу після моделювання трансфузії.

У дисертаційній роботі представлено теоретичне узагальнення і нове рішення наукового завдання, спрямованого на вивчення модифікацій білків мембрано-цитоскелетного комплексу та зміни ліпідної асиметрії в еритроцитах донорської та кордової крові під впливом кріопротектора ПЕО-1500 залежно від температури інкубації клітин з метою підвищення їхньої стійкості до заморожування-відігрівання.

1. Показано, що спрямованість змін білкового спектра мембрано-цитоскелетного комплексу еритроцитів, інкубованих з ПЕО-1500, не залежить від застосування неіонного детергенту сапоніну для одержання тіней еритроцитів.

2. Інкубація еритроцитів донорської та кордової крові з ПЕО-1500 призводить до зміцнення вертикальних зв'язків цитоскелета з плазматичною мембраною, опосередкованих анкірином, б.с.4.2, б.с.4.1, а також до посилення взаємодій у структурі актинових протофіламентів за участі білків смуги 4.9, що сприяє стабілізації клітин до заморожування-відігрівання. При цьому обробка еритроцитів ПЕО-1500 при 0-4⁰С, на відміну від 37⁰С, призводить до збільшення вмісту актину, що в даних умовах свідчить про зміцнення зв'язків у білковому цитоскелеті.

3. Кріоконсервування еритроцитів донорської та кордової крові під захистом ПЕО-1500 призводить до змін відносного вмісту спектрина, анкірина, б.с.3, б.с.4.1, б.с.4.2 і б.с.4.9, що виявляються у розчинах з різною іонною силою та різним вмістом двовалентних катіонів. Дані модифікації залежать від температури інкубації клітин з кріопротектором: інкубація при 0-4⁰С, у порівнянні з 37⁰С, сприяє кращій збереженості цих білків після розморожування клітин. У еритроцитів кордової крові залежність від температури обробки клітин виражена в більшій мірі.

4. Зміни в мембрано-цитоскелетному комплексі еритроцитів кордової та донорської крові, кріоконсервованих під захистом ПЕО-1500, є зворотними при переносі клітин до фізіологічних умов: у еритроцитів, що залишилися цілими, відзначається відповідність контрольним значенням рівнів спектрина, б.с.3, б.с.4.1, б.с.4.9.

5. Оцінка внеску гідрофобних взаємодій до та після кріоконсервування при екстракції тіней еритроцитів донорської та кордової крові в неіонному детергенті Тритон Х-100 виявила Са²⁺-залежне зниження екстрагованості анкірина, актина, б.с.4.1, б.с.4.2, б.с.4.9 у клітин, оброблених кріопротектором при 0-4⁰С. Екстракція тіней еритроцитів кордової крові в Тритон Х-100 виявила збереженість у еритроцитів кордової крові б.с.3, який відсутній у еритроцитів донорської крові.

6. Виявлено високу стійкість глікофорина А до факторів низькотемпературного консервування: обробка еритроцитів ПЕО-1500 не призводить до зниження ступеня його зв'язування з моноклональним антитілом Anti-glicophorin A РЕ, як на етапі інкубації з кріопротектором, так і після заморожування-відігрівання.

7. Виявлено кореляцію між відсотком анексин мічених клітин відразу після розморожування та рівнем гемолізу еритроцитів після перенесення їх до фізіологічних умов. При цьому у еритроцитів як донорської, так і кордової крові, оброблених ПЕО-1500 при 0-4⁰С, порушення асиметрії значно менше після розморожування, ніж у клітин, оброблених при 37⁰С, що корелює з більш низьким рівнем гемолізу після моделювання трансфузії.

Публікації автора:

1. Бабийчук Л.А., Рязанцев В.В., Зубов П.М., Тимченко О.Л. Новые методы криоконсервирования кордовой крови человека под защитой непроникающего криопротектора полиэтиленоксида м.м. 1500 // Проблемы криобиологии.- 2005.- Т.15, №3.- C.556-560.

2. Зубов П.М. Бабийчук Л.А., Рязанцев В.В., Тимченко О.Л. Влияние криопротектора ПЭО-1500 и режимов обработки на асимметрию мембраны эритроцитов в процессе криоконсервирования // Проблемы криобиологии.- 2005.- Т.15, №3.- C.573-574.

3. Зубов П.М., Зубова О.Л., Бабийчук Л.А., Рязанцев В.В. Модификация белков мембрано-цитоскелетного комплекса и липидной асимметрии мембран эритроцитов кордовой и донорской крови до и после криоконсервирования с ПЭО-1500 // Укр. журнал гематології та трансфузіології.- 2006.- №4.- C.41-47.

4. Зубов П.М., Землянских Н.Г., Бабийчук Л.А. Модификация белкового состава мембрано-цитоскелетного комплекса эритроцитов под влиянием ПЭО-1500 // Проблемы криобиологии.- 2006.- Т.16, №2.-C.164-175.

5. Зубов П.М., Землянских Н.Г., Бабийчук Л.А. Изменение содержания спектрина в изолированных цитоскелетах эритроцитов под влиянием ПЭГ-1500 и замораживания-отогрева // Гематологія і переливання крові.- 2006.- №33.- C.109-113.

6. Зубов П.М., Зубова О.Л. Криоконсервирование эритроцитов кордовой крови: влияние на структурно-функциональные показатели клеток / Матер. V міжнар. наук. симпоз. „Актуальні та невирішені питання гематології та трансфузіології”, Київ, 2006 // Новое в гематологии и трансфузиологии.- 2006.- №5.- C.38-42.

7. Патент України № 80062 А01N 1/02. Спосіб кріоконсервування цільної кордової крові. Бабійчук Л.О., Грищенко В.І., Гуріна Т.М., Рязанцев В.В., Зубова О.Л., Зубов П.М.- №200602122; Заявл. 27.02.06; Опубл. 10.08.07. Бюл. №12, 4 c.

8. Зубов П.М. Модифікація білків мембрано-цитоскелетного комплексу еритроцитів під впливом кріопротектору ПЕО-1500 у розчинах з різною іонною силою // Матеріали науково-практичної конференції молодих, присвяченої 350-річчю міста Харкова.- Харків, 2004.- C.36-37.

9. Зубов П.М., Зубова О.Л. Структурно-функціональні показники еритроцитів кордової та донорської крові при кріоконсервування з ПЕО-1500 // Зб. тез Другої міжнародної наукової конференції студентів та аспірантів „Молодь і поступ біології”.– Львів, 2006.- C.49-50.

10. Землянских Н.Г., Зубов П.М., Бабийчук Л.А. ПЭО-1500 модифицирует мембрано-цитоскелетный комплекс эритроцитов человека // Зб. Тез ІХ Українського біохімічного з’їзду.- Харків, 2006.- Т.1.- C.42-43.

11. Бабийчук Л.А., Рязанцев В.В., Зубова О.Л., Зубов П.М. Сравнение структурных и функциональных показателей эритроцитов кордовой и донорской крови до и после криоконсервирования // Зб. Тез ІХ Українського біохімічного з’їзду.- Харків, 2006.-Т.1.- C.31.