Анотація до роботи:

Білий Р.О. Мембранні глікопротеїни клітин за умов апоптозу: виявлення, характеристика, біомедичні аспекти дослідження. – Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.11– цитологія, клітинна біологія, гістологія. Інститут біології клітини НАН України, Львів, 2007.

Отримані у роботі результати доводять існування нового біохімічного маркеру апоптозу у складі плазматичної мембрани – підвищення рівня експонування -D-манозо- та -D-галактозовмісних глікопротеїнів. Даний маркер використано для виявлення та виділення апоптичних клітин зі змішаних популяцій. Виділено манозовмісні глікопротеїни із підвищеним експонуванням при апоптозі та з’ясовано їх локалізацію у плазматичній мембрані. Мас-спектрометрична ідентифікація виділених глікопротеїнів показала, що вони можуть бути задіяні у передачі внутрішньоклітинних сигналів, апоптичних сигналів та формуванні цитоскелету. Вперше запропоновано та експериментально обґрунтовано механізм, який лежить в основі змін у рівні експонування мембранних глікопротеїнів за умов апоптозу: зростання експонування манозо- та галактозовмісних та зменшення експонування сіаловмісних глікопротеїнів на плазматичних мембранах апоптичних клітин пов’язане із модифікацією вже існуючих глікопротеїнів нейрамінідазами в складі плазматичної мембран, а не синтезом глікопротеїнів de novo.

Отримані в роботі результати доводять існування нового біохімічного маркеру апоптозу у складі плазматичної мембрани – підвищення рівня експонування -D-манозо- та -D-галактозовмісних глікопротеїнів. Даний маркер використано для виявлення та виділення апоптичних клітин із змішаних популяцій. Вперше запропоновано та експериментально обґрунтовано механізм, який лежить в основі змін у рівні експонування мембранних глікопротеїнів за умов апоптозу.

1. Під час апоптозу відбувається достовірне зростання рівня експонування мембранних -D-манозо- та -D-галактозовмісних глікокон’югатів, які ідентифіковано як глікопротеїни. Визначено лектини, які із найбільшою ефективністю виявляли ці глікопротеїни – PSL, PMRL, GNA та VAA, RCA, відповідно.

2. Зростання рівня експонування мембранних -D-манозо- та -D-галактозовмісних глікопротеїнів за умов індукції апоптозу не залежить від тканинної чи видової приналежності досліджуваних клітин і справджується як для клітинних систем in vitro, так й in vivo. Дане явище також не залежить від природи індуктора апоптозу – хімічної, фізичної чи біологічної, та від особливостей культивування клітинних ліній та способу від`єднання клітин від поверхні субстрату.

3. Рівень експонування мембранних глікопротеїнів перебуває у прямо пропорційній залежності (r=0,895) від концентрації апоптоз-індукуючого чинника і виявляється через 6-12 годин після індукції апоптозу. Глікопротеїни із підвищеним рівнем експонування при апоптозі здатні до інтерналізації в клітину.

4. Виділено манозовмісні глікопротеїни із підвищеним експонуванням при апоптозі та встановлено, що вони локалізовані у плазматичній мембрані периферично та інтегрально. Мас-спектрометрична ідентифікація виділених глікопротеїнів показала, що вони можуть бути задіяні у передачі внутрішньоклітинних сигналів, зокрема до апоптозу, та у формуванні цитоскелету.

5. Розроблено метод лектин-афінної хроматографії для виділення апоптичних клітин зі змішаної популяції з інтактними клітинами. Який базується на вибірковому зв`язуванні афінним сорбентом апоптичних клітин із підвищеним рівнем експонування манозо- та галактозовмісних глікопротеїнів.

6. Розроблено метод індукованої лектином аглютинації для швидкої детекції апоптозу в популяції клітин. Доведено ефективність методу при визначенні рівня апоптозу лімфоцитів крові хворих із автоімунними розладами.

7. Зміна рівня експонування мембранних -D-манозо- та -D-галактозовмісних глікопротеїнів не залежить від їх синтезу de novo.

8. Зростання рівня експонування мембранних манозо- та галактозовмісних глікопротеїнів при індукції апоптозу супроводжується одночасним зниженням рівня експонування сіаловмісних глікопротеїнів. Інгібування нейрамінідазної активності перешкоджає зміні рівня експонування згаданих глікопротеїнів при апоптозі. Активність нейрамінідаз на поверхні Т-клітин лінії Jurkat за умов апоптозу зростає більше, ніж у 40 разів (3,26 мU/млн. клітин), порівняно з активністю на поверхні інтактних клітин (0,078 мU/млн. клітин).

9. Обґрунтовано механізм перерозподілу глікопротеїнів на поверхні апоптичних клітин. Він полягає у тому, що саме десіалування існуючих на інтактних клітинах глікопротеїнів призводить до зростання рівня експонування мембранних манозо- та галактозовмісних глікопротеїнів та одночасного зниження рівня експонування сіаловмісних глікопротеїнів.

Публікації автора:

1. Bilyy R.O. Stoika R.S. Lectinocytochemical detection of apoptotic murine leukemia L1210 cells // Cytometry - 2003. - Vol. 56A, No. 2. - P.89-95.

2. Bilyy R.O., Antonyuk V.O., Stoika R.S. Cytochemical study of role of alpha-d-mannose- and beta-d-galactose-containing glycoproteins in apoptosis // J. Mol. Histol. - 2004. - Vol.35, No. 8-9. - P.829-838.

3. Chorna I., Bilyy R., Datsyuk L., Stoika R. Comparative study of human breast carcinoma MCF-7 cells differing in their resistance to doxorubicin: effect of ionizing radiation on apoptosis and TGF-beta production // Exp Oncol - 2004. - Vol.26, No. 2. - P.111-117.

4. Bilyy R., Kit Y., Hellman U., Tryndyak V., Kaminskyy V., Stoika R. In vivo expression and characteristics of novel alpha-d-mannose-rich glycoprotein markers of apoptotic cells // Cell Biol. Int. - 2005. - Vol.29, No. 11. - P.920-928.

5. Білий Р.О., Антонюк В.О., Стойка Р.С. Глікопротеїни плазматичної мембрани апоптичних клітин та їх використання для кількісної оцінки запрограмованої смерти клітини (апоптозу) // Праці Наукового товариства імені Шевченка, Хемія і Біохемія - 2005. - Т.15, С.186-192.

6. Bilyy R.O., Bilyi A.I., Getman V.B., Kit, Yu.Ya. Mayor Ch.Ya., Antonyuk V.O., Stoika R.S.. Some new approaches to the detection of programmed cell death // Proc. SPIE Int. Soc. Opt. Eng. - 2006. - Vol.6163, No. 1. - P.61630J.

7. Stoika R.S., Bilyy R.O., Antonyuk V.O. Agglutination-based method for fast detection, isolation and quantification of apoptotic cells. 2006. – Пат. заявка. PCT N60/731,768, 1-85. PCT. 5 A.D.

8. Bilyy R.O., Stoika R.S. Novel plasma membrane markers of apoptotic cells. // Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics. -Київ: 2003.- C. 46.

9. Білий Р.О., Стойка Р.С. Лектини – маркери апоптичних клітин // V Всеукраїнська студентська наукова конференція "Актуальні проблеми природничих та гуманітарних наук у дослідженнях студентської молоді". -Черкаси: 2003.- C. 4.

10. Bilyy R.O., Antoniuk V.O., Stoika R.S. Changed glycoprotein expression in apoptotic cells: a novel marker for apoptosis // 29^th FEBS Congress. - Warsaw, Poland: European Journal of Biochemistry, 2004.- V. 271. - P. 154.

11. Bilyy R.O., Antoniuk V.O., Stoika R.S. Changed glycoprotein expression in apoptotic cells: a novel marker for apoptosis. // FEBS Forum for Young Scientists. - Warsaw, Poland: 2004.- P. 15.

12. Bilyy R.O., Antoniuk V.O., Stoika R.S. Study of glycoprotein expression in apoptotic cells // Установчий з'їзд Українського товариства клітинної біології. - Львів: 2004.- C. 342.

13. Bilyy R.O., Kit Yu.Ya., Antoniuk V.O., Stoika R.S. -D-Mannose and -D-falactose specifiec lectins as novels tools for early detection of apoptotic cells // ІІ Всеукраїнська науково-практична конференція „Біотехнологія. Освіта. Наука". - Львів: 2004.- C. 80.

14. Bilyy R.O., Kit Yu.Ya., Antoniuk V.O., Stoika R.S. Characteristics of specific membrane receptors of apoptotic cells // 5-та Парнасівська конференція. - Київ: Український біохімічний журнал, 2005.- N. 77. - C. 96.

15. Bilyy R.O., Kit Yu.Ya., Hellman U., Stoika R.S. Mannose-rich glycoproteins - novel early markers of apoptotic cells: in vivo characteristics // 40th Meeting of the Polish Biochemical Society. - Lublin, Poland: Acta Biochimica Polonica, 2005.- V. 52. - P. 128.

16. Stoika R.S., Bilyy R.O., Kit Yu.Ya., Antoniuk V.O. Novel approaches for detection, study and isolation of apoptotic cells // 5-та Парнасівська конференція. - Київ: Український біохімічний журнал, 2005.- N. 77. - C. 38.

17. Bilyy R.O., Bilyi A.I., Getman V.B., Kit Yu.Ya., Antoniuk V.O., Stoika R.S. Some new approaches to the detection of programmed cell death // Saratov Fall Meeting, SFM'05, International School for Junior Scientists and Students on Optics, Laser Physics and Biophysics. - Saratov, Russia: 2005.- P. 176.

18. Bilyy R.O. Mannose-rich glycoproteins – novel tools for identification of apoptotic cells // Конференція молодих вчених Інституту біології клітини НАНУ. – Львів: 2005. – С. 8.

19. Bilyy R.O., Antoniuk V.O., Mayor C.Ya., Hellman U., Stoika R.S. Detection and study of apoptotic cells by using glycobiological approaches // IX Український біохімічний з'їзд. - Харків: Матеріали IX Українського біохімічного з'їзду, 2006.- Т. 2. - С. 3.

20. Толстяк Я., Білий Р., Вальчук І. Маркери цитотоксичності у пацієнтів з автоімунними хворобами // 68-а Студентська наукова конференція «Досягнення сучасної медицини». - Львів: 2007. – С. 40.

21. Bilyy R.O. Mechanism of plasma membrane glycoprotein redistribution during apoptosis // Конференція молодих вчених Інституту біології клітини НАНУ. – Львів: 2006. – С. 25.