Анотація до роботи:

Білан П.В. Механізми внутрішньоклітинної кальцієвої регуляції в екзокринних клітинах. Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.02 - біофізика. Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України, Київ, 2005.

Дисертація присвячена дослідженню різноманітних клітинних механізмів, що приймають участь у скоординованій регуляції іонів кальцію у екзокринних клітинах. У роботі було досліджено зміни у концентрації Ca²⁺ поблизу ізольованих секреторних гранул та показано, що відомі вторінні посередники IP₃ та cADPr викликають швидке вивільнення Ca²⁺ із гранул, чим можна пояснити явище викликаного агоністом підвищення цитозольної [Ca²⁺] в секреторному полюсі ацинарних клітин. Було також показано, що секреторний полюс є головним місцем вивільнення Ca²⁺ із ацинарних клітин внаслідок стимуляції агоністом; це має місце завдяки відносно високу щільність розташування кальцієвих насосів у апікальній мембрані ацинарних клітин. За допомогою новітніх методів досліджень, розроблених під час виконання роботи, було встановлено, що ізопротеренол спричиняв помітні зміни у вигляді спайків концентрації зовнішньоклітинного кальцію. Відсутність зростання [Ca²⁺]_i та пульсоподібна природа змін у зовнішньоклітинної [Ca²⁺] вказують на те, що ці спайки з’являються, найвірогідніше, внаслідок вивільнення кальцію із секреторних гранул. Величина викликаного ізопротеренолом вивільнення кальцію була досить значною. Зроблено висновок про те, що у секреторних клітинах кальцій вивільняється у люмен шляхом екзоцитозу, і що екзоцитоз може бути основним механізмом вивільнення кальцію у позаклітинний простір із екзокринних та інших типів секреторних клітин.

1. У дисертаційній роботі наведені дослідження різноманітних клітинних механізмів, що приймають участь у скоординованій регуляції іонів кальцію у екзокринних клітинах.

2. Розроблено новий метод - метод краплини – що є першим методом, який дозволив кількісно вимірювати кінетику виведення іонів кальцію із поодиноких клітин ссавців.

3. Розроблено нову методику для просторового спостереження малих трансмембранних потоків іонів кальцію у секреторних гранулах, поодиноких клітинах та малих клітинних агрегатах, в основі якої лежить ідея використання флуоресцентного кальцієвого індикатору, зв'язаного із високомолекулярними декстранами для сповільнення дифузії іонів кальцію.

4. Показано, що IP₃ та cADPr викликають помітне спадання концентрації вільного інтрагранулярного Ca²⁺. Використовуючи новий метод просторового спостереження малих трансмембранних потоків іонів кальцію, вимірено зміни у концентрації Ca²⁺ поблизу ізольованих секреторних гранул та показано, що IP₃ та cADPr викликають швидке вивільнення Ca²⁺ із гранул, чим можна пояснити явище викликаного агоністом підвищення цитозольної [Ca²⁺] в секреторному полюсі ацинарних клітин, яке необхідне для процесу секреції ферментів.

5. Застосувавши нову методику, у якій висока ступінь роздільної здатності при локалізації місць вивільнення клітинного Ca²⁺ досягалася за допомогою конфокальної мікроскопії та Ca²⁺-чутливого флуоресцентного барвника, зв’язаного із важким декстраном, було показано, що секреторний полюс є головним місцем вивільнення Ca²⁺ із ацинарних клітин внаслідок стимуляції агоністом.

6. Показано, що під час стимульованого агоністом підвищення кальцію або під час вивільнення кальцію із зв’язаного стану всередині клітини, Ca²⁺ виводиться із апікального секреторного полюсу клітини. Це найвірогідніше відбувається через відносно високу щільність розташування кальцієвих насосів у апікальній мембрані ацинарних клітин. Інтенсивність вивільнення Ca²⁺ із апікального секреторного полюсу є такою, що протягом часу стимуляції агоністом відбуваються значні (по кілька мілімолей на літр) зміни у концентрації вільного кальцію в люмені ацинуса, необхідні для стимуляції ендоцитозу, що слідує за секрецією.

7. За допомогою нової методики для вимірювання концентрації зовнішньоклітинного кальцію поблизу клітинної мембрани та методики краплини було показано, що ізопротеренол, -адренергічний агоніст та потужний секреторний агент, не викликав змін у концентрації вільного Ca²⁺ у цитозолі, але спричиняв помітні зміни у вигляді спайків концентрації зовнішньоклітинного кальцію. Відсутність зростання [Ca²⁺]_i та пульсоподібна природа змін у [Ca²⁺]_o вказують на те, що ці спайки з’являються, найвірогідніше, внаслідок вивільнення кальцію із секреторних гранул.

8. Холінергічний агоніст ацетилхолін викликав значне зростання [Ca²⁺]_i та ”гладке” за формою зростання [Ca²⁺]_o, які, були спричинені роботою кальцієвих насосів плазматичних мембран, із накладанням коротких спайків [Ca²⁺]_o, що були викликані екзоцитом кальцію у зовнішньоклітинне середовище.

9. Величина викликаного секрецією вивільнення кальцію була досить значною. Обчислена величина втрат кальцію протягом перших 100 секунд при супрамаксимальній стимуляції відповідає зменшенню загальної концентрації кальцію в клітині на 0.4 мМ.

10. Зроблено висновок про те, що в екзокринних клітинах кальцій може вивільнюватися в люмен шляхом екзоцитозу, і що екзоцитоз (а не кальцієві АТФфази плазматичної мембрани) може бути основним механізмом вивільнення кальцію у навколоклітинний простір в екзокринних та інших типах секретуючих клітин.