Анотація до роботи:

Камінський В.О. Механізми індукції апоптозу у лімфомних клітинах під впливом алкалоїдів чистотілу. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.11-цитологія, клітинна біологія, гістологія. – Інститут біології клітини НАН України, Львів, 2006.

Дисертація присвячена вивченню механізмів індукції апоптозу під впливом чотирьох основних алкалоїдів чистотілу (Chelidonium majus L.) хелідоніну, сангвінарину хелеритрину та коптизину.

Встановлено, що хелідонін, сангвінарин, хелеритрин та коптизин індукують апоптоз, який реалізується на мітохондріальному рівні, про що свідчить вивільнення цитохрому с з мітохондрій, активація каспази-9 та каспази-3. Індукція апоптозу лімфомних клітин під впливом цих алкалоїдів може реалізуватись також із залученням каспази-8, яка приймає участь у здійсненні рецептор-опосередкованого шляху апоптозу.

У механізмах індукції апоптозу сангвінарином, хелеритрином та коптизином залучені їх пошкоджуючий вплив на мітохондрії та інтеркаляція у структуру ДНК лімфомних клітин. Сангвінарин і хелеритрин є сильними інтеркаляторами в структуру ДНК лімфомних клітин, спричиняють одно- та двониткові розриви в ланцюгах ДНК, знижують трансмембранний потенціал мітохондрій а також вміст ATP на ранніх етапах своєї дії. Хелідонін не інтеркалює у структуру ДНК лімфомних клітин, зупиняє клітинний цикл у G2/M фазі та активує проапоптичну дію білка Bad.

У дисертаційній роботі проведено порівняльне дослідження механізмів індукції апоптозу лімфомних клітин під впливом чотирьох алкалоїдів чистотілу (сангвінарин, хелеритрин, коптизин, хелідонін). Виявлено найбільш ефективні індуктори апоптозу у культурі лімфомних клітин.

1. Сангвінарин та хелеритрин проявляють найвищу цитотоксичну дію щодо лімфомних клітин людини ліній CCRF-СЕМ, Jurkat, МТ-4 та лімфоми миші NK/Ly in vitro. Пів-максимальний цитотоксичний ефект цих алкалоїдів знаходиться у межах 0,5-1,5 мкг/мл. Хелідонін та коптизин характеризуються помірною цитотоксичністю, а пів-максимальний цитотоксичний ефект хелідоніну близький до 3 мкг/мл і коптизину – 10 мкг/мл.

2. Найбільш ефективними індукторами апоптозу у культурі лімфомних клітин є хелідонін, сангвінарин та хелеритрин. Індукція апоптозу сангвінарином, хелеритрином та коптизином реалізується за участю мітохондрій і супроводжується вивільненням цитохрому с із мітохондрій, активацією ініціюючої каспази-9 та ефекторної каспази-3. Апоптоз лімфомних клітин під впливом хелідоніну реалізується шляхом підвищення рівня проапоптичного білка Bad, вивільненням цитохрому с з мітохондрій, активації ініціюючої каспази-9 та ефекторної каспази-3. Реалізація апоптозу під впливом досліджуваних алкалоїдів відбувається також із залученням ініціюючої каспази-8.

3. При дії на клітини лінії МТ-4 лімфоми людини хелідонін (2,5 мкг/мл) зумовлює достовірне зростання частки клітин у G2/M фазах (55 % порівняно з 19 % у контролі).

4. У механізмах індукції апоптозу лімфомних клітин сангвінарином, хелеритрином та коптизином задіяні процеси інтеркалювання цих алкалоїдів у структуру ДНК, тоді як у хелідоніну властивості інтеркалятора відсутні він не взаємодіє з ДНК.

5. Сангвінарин та хелеритрин індукують як апоптичну, так і некротичну загибель. Однією з причин некротичної загибелі клітини під впливом сангвінарину та хелеритрину є колапс трансмембранного потенціалу мітохондрій, який зумовлює блокування процесів окисного фосфорилювання та спряженого з ним синтезу ATP у мітохондріях.

6. Сангвінарин та хелеритрин у концентрації 2 мкг/мл через 3 год дії призводять до зниження рівня ATP у клітинах лінії CCRF-CEM на 65-80 % порівняно з контролем. Хелідонін (5 мкг/мл) підвищує рівень внутрішньоклітинного ATP у клітинах лінії CCRF-CEM на 25-30 %, тоді як коптизин (5 мкг/мл) достовірно не впливає на вміст внутрішньоклітинного ATP.

7. Сангвінарин та хелеритрин індукують ранні стадії апоптозу, про що свідчить активація ними компонентів каспазної системи та структурні зміни ядра вже на 6-ту год дії цих речовин. Апоптичні зміни ядра під впливом хелідоніну та коптизину виявляються на 24-ту год дії цих алкалоїдів на лімфомні клітини.

Публікації автора:

1. Осип Ю.Л., Камінский В.О., Луцик М.Д., Стойка Р.С. Вплив складу розчинника та інтеркалюючих лігандів на конформаційну стабільність молекули ДНК // Медична хімія. – 2004. – Т. 6, № 3. – С. 30-33. (Дисертанту належить визначення впливу різних чинників на ДНК, виділення ДНК, пошук та аналіз даних літератури, участь в аналізі результатів та написання статті).

2. В.О. Камінський, М.Д. Луцик, Р.С. Стойка. Аналіз фрагментації ДНК індивідуальних клітин методом гель-мікроелектрофорезу: модифікація фарбування солями срібла для отримання постійних препаратів // Український біохімічний журнал 2005. – Т.77, № 6. – с. 89-92. (Дисертанту належить підготовка зразків для дослідів, розробка методу фарбування ДНК-комет, пошук та аналіз даних літератури, участь у написанні статті).

3. Kaminskyy V.O., Lootsik M.D., Stoika R.S. Cytotoxic activity of various greater celandine alkaloids correlates with their DNA intercalating properties and ability to induce breaks in DNA of NK/Ly murine lymphoma cells // Central European Journal of Biology 2005. - Vol. 1, № 1. – P. 2-15. (Дисертанту належить визначення цитотоксичного ефектів алкалоїдів на досліджувані клітини, виділення ДНК, дослідження інтеркаляторної здатності алкалоїдів, проведення та аналіз ДНК-комет, пошук та аналіз даних літератури, участь в аналізі результатів та написання статті).

4. В.О. Камінський, Н.В. Крив’як, М.Д. Луцик, Р.С. Стойка. Вплив алкалоїдів чистотілу на кальцієву ємність та окисне фосфорилювання мітохондрій у залежності від здатності інтеркалювати в структуру ДНК // Український біохімічний журнал 2006. – Т.78, № 2. – с. 28–33 (Дисертанту належить підготовка зразків для досліду, участь у експериментах, пошук та аналіз даних літератури, участь в аналізі результатів та написання статті).

5. Lutsik M. D., Kaminsky V. O., Stoika R. S. Determination of tumor cells response to chemotherapeutic drugs by different methods of quantitative evaluation of apoptosis // 5 Parnas Сonference Molecular Mechanisms of Cellular Signaling. – Kyiv. – April 29, 2005. – p. 125. (Дисертант брав участь у проведенні досліджень, статистичній обробці результатів, аналізі експериментальних даних, оформленні тез).

6. Завелевич М.П., Фільченков О.О., Храновська Н.М., Осип Ю.Л., Камінський В.О., Луцик М.Д., Стойка Р.С. Вплив хелідоніну, хелеритрину та сангвінарину на клітинний цикл лінії лімфобластної лейкемії людини МТ-4: порівняльний аналіз із їх ДНК-зв’язувальною здатністю // Основи молекулярно-генетичного оздоровлення людини і довкілля. – Київ. – 31 травня-1 червня, 2005. – с. 67-69. (Дисертант брав участь у проведенні досліджень, статистичній обробці результатів, аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні тез).

7. В. О. Камінський. Визначення чутливості пухлинних клітин до алкалоїдів із застосуванням тестів на пошкодження структури ДНК та хроматину // Сучасні проблеми біохімії та біотехнології. Київ. – червень, 2005. – с. 16 (Дисертант брав участь у проведенні досліджень, статистичній обробці результатів, аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні тез).

8. Камінський В.О. Порівняльний аналіз проапоптичної активності індивідуальних алкалоїдів чистотілу. – Київ. – 2-3 лютого, 2006. – с. 37 (Дисертант брав участь у проведенні досліджень, статистичній обробці результатів, аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні тез).

9. Фильченков А.А., Каминский В.А., Завелевич М.П., Стойка Р.С. Активация каспазной системы в клетках лимфобластного лейкоза человека при индукции апоптоза алкалоидами хелидонином и сангвинарином // Отечественные противоопухолевые препараты. – Москва. – 21-24 марта, 2006. – с. 6. (Дисертант брав участь у проведенні досліджень, статистичній обробці результатів, аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні тез).

10. Каминский В.А., Фильченков А.А., Завелевич М.П., Храновская Н.М., Стойка Р.С. Сравнительный анализ апоптозиндуцирующего действия алкалоидов чистотела на клетки лимфобластного лейкоза человека // Отечественные противоопухолевые препараты. – Москва. – 21-24 марта, 2006. – с. 14. (Дисертант брав участь у проведенні досліджень, статистичній обробці результатів, аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні тез).

11. Камінський В.О., Стойка Р.С. Проапоптична дія алкалоїдів чистотілу у культурі лімфомних клітин. // Конференція молодих вчених Інституту біології клітини НАНУ. –Львів. – 30 травня, 2006. – с. 6. (Дисертант брав участь у проведенні досліджень, статистичній обробці результатів, аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні тез).