Анотація до роботи:

Горохова Н.А. Кріоконсервування культивованих фібробластоподібних клітин шляхом повільного заморожування і вітрифікації. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.19 –кріобіологія. – Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків, 2008.

Дисертаційна робота присвячена дослідженню морфофункціонального стану культивованих фібробластоподібних клітин (ФПК) людини ранніх стадій органогенезу після кріоконсервування шляхом повільного заморожування під захистом диметилсульфоксида (ДМСО) та вітрифікації в багатокомпонентних розчинах кріопротекторів.

Установлено, що близько 95% клітин в культурах ФПК 4-го – 12-го пассажів експресують характерний для мезенхімальних стромальних клітин імунофенотип – позитивні за маркерами CD29, CD44, CD73, CD105 і негативні за маркерами CD34, CD38, CD45. Виявлено здатність культивованих ФПК до індукованого диференціювання в остеогенному і адипогенному напрямах.

Кріоконсервування клітин зі швидкістю 1/хв до -80С під захистом 10% ДМСО дозволяє значною мірою зберегти життєздатність і метаболічну активність ФПК, а також їх здатність до спрямованого остеогенного і адипогенного диференціювання.

Досліджено можливість ефективного кріоконсервування суспензії ФПК шляхом вітрифікації. Показано, що застосування розчину, що містить ДМСО, етиленгліколь, 1,2-пропандіол і цукрозу, для вітрифікації культивованих ФПК ранніх стадій органогенезу дозволяє зберегти їх морфофункціональні властивості та здатність до диференціювання в остеогенному і адипогенному напрямах.

У роботі наведені теоретичне узагальнення та вирішення наукової проблеми низькотемпературного консервування фібробластоподібних клітин людини ранніх стадій органогенезу, що мають імунофенотип і диференціювальні властивості мультипотентних мезенхімальних стромальних клітин.

1. Імунофенотипічний аналіз показав, що культивовані фібробластоподібні клітини людини ранніх стадій органогенезу експресують характерний для МСК імунофенотип (позитивні за CD29, CD44, CD73, CD105 і негативні за CD34, CD38, CD45); вміст клітин з даним імунофенотипом становить близько 95% і не змінюється у перебігу субкультивування до 12-го пасажу.

   Встановлено, що фібробластоподібні клітини людини ранніх стадій органогенезу здатні до індукованого диференціювання в остеогенному і адипогенному напрямах в умовах моношарового культивування.

   Аlamar Вlue-тест є чутливим методом визначення збереженості, метаболічної та проліферативної активності фібробластоподібних клітин ранніх стадій органогенезу; Аlamar Вlue відновлюється в клітинах з неушкодженою мембраною, що адгезували до субстрату, і рівень його флуоресценції зростає в процесі культивування.

   Кріоконсервування шляхом повільного заморожування під захистом 10% диметилсульфоксида дозволяє значною мірою зберегти життєздатність і метаболічну активність фібробластоподібних клітин людини ранніх стадій органогенезу, а також їх здатність до диференціювання в остеогенному і адипогенному напрямах.

   Показано, що під час швидкого заморожування й відігрівання розчинів, що містять 10% диметилсульфоксида, 20% етиленгліколя, 20% 1,2-пропандіола і 0,5 М цукрози або 10% диметилсульфоксида, 15% етиленгліколя, 15% 1,2-пропандіола і 1 М цукрози, об’ємом 0,5 мл у пластикових кріопробірках виключається розвиток кристалізації.

   Застосування розчину, що містить 10% диметилсульфоксида, 20% етиленгліколя, 20% 1,2-пропандіола і 0,5 М цукрози, для вітрифікації суспензії культивованих фібробластоподібних клітин людини ранніх стадій органогенезу дозволяє зберегти їх морфофункціональні властивості та здатність до диференціювання в остеогенному і адипогенному напрямах.

Публікації автора:

1. Петренко Ю.А. Влияние высокомолекулярных соединений на жизнеспособность и функциональную активность клеток эмбриональной печени человека до и после криоконсервирования / Ю.А. Петренко, Н.А. Горохова, А.Ю. Петренко // Проблемы криобиологии. — 2005. — Т. 15, № 3. — С. 375 — 379.

2. Определение метаболической активности свежевыделенных и криоконсервированных клеток эмбриональной печени человека с помощью Alamar Blue-теста / Ю.А. Петренко, Н.А. Горохова, Б.П. Сандомирский, А.Ю. Петренко // Проблемы криобиологии. — 2005. — Т. 15, № 4. — С. 599—606.

3. The reduction of Alamar Blue by peripheral blood lymphocytes and isolated mitochondria / Yu.A. Petrenko, N.A. Gorokhova, E.N. Tkachova, A.Yu. Petrenko // Укр. Біохім. Журн. — 2005. — Vol. 77, № 5. — Р.100—105.

4. Morphological and functional assessment of human fetal liver cells in long-term culture / P. Todorov, R.Konakchieva, J. Dimitrov, V. Novachkov, D. Kyurkchiev, N. Tchoob, S. Drokin, N. Gorokhova // Проблемы криобиологии. — 2006. — Т. 16, № 2. — С. 201—206.

5. Горохова Н.А. Выбор криозащитной среды для витрификации суспензии эмбриональных фибробластоподобных клеток / Н.А. Горохова, Ю.А. Петренко, А.Ю. Петренко // Проблемы криобиологии. — 2007. — Т. 17, № 1. — С. 50—58.

6. Выделение и дифференцировка стромальных клеток из тканей плодов и взрослого человека / А.Ю. Петренко, С.П. Мазур, Ю.А. Петренко, Н.Г. Скоробогатова, Н.А. Горохова, Н.А. Волкова // Трансплантология. — 2007. — Т. 9, № 1. — С. 218—220.

7. Культивирование стромальных клеток-предшественников в трехмерных носителях / Ю.А. Петренко, А.Ю. Петренко, В.И. Лозинский, И.В. Гурин, Н.А. Горохова, Н.А. Волкова, Б.П. Сандомирский // Трансплантология. — 2007. — Т. 9, № 1. — С. 221—223.

8. Горохова Н.А. Alamar Blue-тест как метод определения жизнеспособности клеток до и после криоконсервирования / Н.А. Горохова, Ю.А. Петренко // Проблемы криобиологии. — 2005. — Т. 15, № 4. — С. 728—729.

9. Gorokhova N.A. Alamar Blue-test as a method of assessing metabolic activity of human embryonic cells / N.A. Gorokhova, Yu.A. Petrenko, E.N. Tkachova // Збірник тез Другої міжнародної наукової конференції студентів та аспірантів [„Молодь і поступ біології”]. — Львів, 2006. — С. 353—354.

10. Изучение активности метаболических процессов в клетках по восстановлению ресазурина / Н.А. Горохова, Ю.А. Петренко, Е.Н. Ткачева, А.Ю. Петренко // IX Український біохімічний з’їзд : Тез. доп. — Харків, 2006. — С. 117.

11. Горохова Н.А. Криоконсервирование фетальных фибробластоподобных клеток человека методом витрификации / Н.А. Горохова // Проблемы криобиологии. — 2006. — Т. 16, № 4. — С. 423.

12. The effect of cryopreservation on the differentiation potential of human fetal fibroblast-like cells / N.A. Gorokhova, Yu.A. Petrenko, N.A. Volkova, A.I. Pravduk, A.Yu. Petrenko // Abstracts of the 6^th Parnas Conference Molecular Mechanism of Cellular Signalling, Krakоw, Poland. — Acta Biochimica Polonica. — 2007. — Supplement 2. — P. 15.

13. Горохова Н.А. Жизнеспособность клеток после экспозиции и быстрого замораживания-отогрева в многокомпонентных витрифицирующих растворах / Н.А. Горохова // Проблемы криобиологии. — 2007. — Т. 17, № 2. — С. 199.

14. Multilineage differentiation of human stromal cells isolated from different sources / A.Yu. Petrenko, Yu.A. Petrenko, N.G. Skorobogatova, A.I. Pravduk, N.A. Gorohova, N.A. Volkova, S.P. Mazur, V.P. Grischuk // ІІІ Всероссийский симпозиум с международным участием [«Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» ] : Сб. тезисов. — Москва, 2007. — С. 90.

15. Growth and differentiation of human stromal cells in two- and three-dimensional carriers / A.Yu. Petrenko, Yu.A. Petrenko, A.I. Pravduk, N.A. Gorokhova, V.I. Lozinsky, L.G. Damshkaln, I.V. Gurin, Yu.V. Malutin, I.A. Borovoy, N.G. Skorobogatova, N.A. Volkova, S.P. Mazur // 2-ий З’їзд українського товариства клітинної біології : Тез. доп. — Київ, 2007. — С. 213.