Анотація до роботи:

Ковтунович Г. Л. Клонування та аналіз структури і функцій гена екзополігалактуронази ендофітної бактерії Klebsiella oxytoca VN13. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.22 - молекулярна генетика. - Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Київ, 2002.

У роботі викладено результати досліджень пектолітичної системи ендофітної бактерії K. oxytoca VN13, що застосовується як основа біопрепаратів для рослин. Встановлено зв'язок між рівнем пектолітичної активності цієї бактерії, рівнем внутрішньотканинної колонізації та ефективністю її впливу на рослину-асоціат.

Клоновано та визначено нуклеотидну послідовність гена pehX, що кодує гідролітичний фермент екзополігалактуроназу. Проведено аналіз регуляторних елементів даного гена. Встановлено наявність kdgR-регулона в даній бактерії. Аналіз виведеної амінокислотної послідовності кодованого білка вказує на існування сигнального пептиду в первинному транслянті. Створено неактивний мутант по pehX гену та досліджено його участь у процесах катаболізму пектину та взаємодії з коренями рослин.

Унікальність нуклеотидної послідовності клонованого гена використано для розробки методу ідентифікації K. oxytoca на основі полімеразної ланцюгової реакції.

1. Встановлено позитивну кореляцію між рівнем пектолітичної активності K. oxytoca VN13, ефективністю колонізації цією бактерією коренів рослин та рівнем її впливу на ріст проростків пшениці.

2. Виділено Pel⁺-форми K. oxytoca VN13 з підвищеною пектолітичною активністю та ефективністю колонізації коренів пшениці. Підвищена концентрація бактерій на поверхні та всередині коренів позитивно впливає на ріст проростків пшениці, що робить перспективним використання даних форм бактерій для виготовлення біопрепаратів.

3. Створено плазмідний банк генів K. oxytoca VN13 та ідентифіковано клон з екзополігалактуроназною активністю. Визначено повну нуклеотидну послідовність клонованого та прилеглих ділянок ДНК, що, в цілому, становить 2541 н. п.

4. Проаналізовано промоторну ділянку гена pehX та визначено регуляторні елементи, які вказують на існування KdgR –регулона в K. oxytoca VN13.

5. Створено мутант з інактивованим pehX-геном, який зберігав здатність до колонізації внутрішніх тканин коренів рослин, що можна пояснити екзосубстратною специфічністю відповідного ферменту та його периплазматичною локалізацією. Даний мутант також зберігав здатність до засвоєння полігалактуронату натрію.

6. На основі унікальності визначеної послідовності ДНК pehX-гена, розроблено праймери та відпрацьовано методику ідентифікації K. oxytoca методом ПЛР.

Публікації автора:

1. Петак А.М., Ковтунович Г.Л., Козыровская Н.А., Туряница А.И., Кордюм В.А. Взаимоотношения бактерий рода Klebsiella с растением. 2. Локализация бактерий Klebsiella oxytoca и K. terrigena в тканях табака и пшеницы // Биополимеры и клетка. - 1995. - Т. 11, № 6. - C. 75-79.

2. Kozyrovska N., Kovtunovych G., Gromosova E., Kuharchuk P., Kordyum V. Novel inoculants for an environmentally-friendly crop production // Resources, Conservation and Recycling. - 1996. - Vol. 18. - P. 79-85.

3. Kovtunovych G., Lar O., Kordyum V., Kleiner D., Kozyrovska N. Enhancing the internal plant colonization rate with endophytic nitrogen-fixing bacteria // Биополимеры и клетка. - 1999. - Т. 15, № 4. - С. 300-305.

4. Kovtunovych G., Lar O., Kamalova S., Kordyum V., Kleiner D., Kozyrovska N.. Correlation between pectate lyase activity and ability of diazotrophic Klebsiella oxytoca VN13 to penetrate into Plant Tissues by // Plant and Soil. - 1999. - Vol. 215.- P. 1-6.

5. Ковтунович Г.Л., Лар О.В., Козировська Н.О. Клонування та структурний аналіз peh-гена Klebsiella oxytoca VN13 // Биополимеры и клетка. - 2000. - Т.16, № 5. - С. 356-362.

6. Kovtunovych G. L., Lar О. V.,. Kozyrovska N. О. Ecologicaly-frendly crop production with microbial inoculаnts. III. Molecular detection of Klebsiella oxytoca in the environment // Науковий вісник Ужгородського національного університету. Серія біологія. - 2001. - № 9. - С. 79-80.

7. Ковтунович Г.Л., Лар О.В., Козировська Н.О. Роль гена екзополігалактуронази у процесах взаємодії Klebsiella.oxytoca VN13 з коренями проростків пшениці // Біополімери і клітина. - 2002. - Т. 18, № 4. - С. 319-323.

8. Kovtunovych G., Kordyum V., Kleiner D., Kozyrovska N. Correlation between pectate lyase activity and penetration inside the plant tissue in diazotrophic klebsiellas // Third European Nitrogen Fixation Conference. - Lunteren (The Netherland). - 1998. - P. 181.

9. Kovtunovych G., Lar О., Kozyrovska N. Molecular mechanisms of diazotrofic Klebsiella oxytoca enter inside the plant tissue: the role of polygalacturonase and pectate lyase // Fourth European Nitrogen Fixation Conference. - Seville (Spain). - 2000. - P. 151.