Анотація до роботи:

Немазаний І.О. Клонування гена та характеристика білка-партнера протеїнкінази рибосомного білка S6 коензим А-синтази. Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.03 – молекулярна біологія. - Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, Київ, 2004.

Роботу присвячено пошуку та характеристиці білків партнерів кінази S6 рибосомального білка (S6K1) методом дріжджової двогібридної системи. В результаті проведеного скринування кДНК бібліотеки ембріонів миші ідентифіковано кДНК нового S6K1-зв’язувального білка – КоА-синтази. Вперше клоновано кДНК ген, що кодує КоА-синтазу. Доведено, що КоА-синтаза має дефосфоКоА-кіназну та фосфопантотенатаденілтрансферазну активності та каталізує два останні етапи біосинтезу КоА.

Вперше показано, що КоА-синтаза взаємодіє з S6K1 у клітинах дріжджів та у клітинах ссавців. Встановлено, що С-кінцеві ділянки S6K1 та КоА-синтази залучені до утворення білкового комплексу.

Продемонстровано мітохондріальну локалізацію КоА-синтази методами конфокальної мікроскопії та субклітинного фракціонування з використанням специфічних антитіл. Виявлено, що КоА-синтаза не є субстратом для S6K1 та, що обидва ферменти не впливають на активність одне одного. Запропоновано, що ця взаємодія має структурну роль і дає можливість S6K1 наблизитися до мітохондрії з метою фосфорилювання її мітохондріальних субстратів.

У дисертаційній роботі методом двогібридної системи дріжджів ідентифіковано та досліджено S6K зв’язувальний білок – КоА-синтазу. Вперше виявлено зв’язок ензимів сигнальних шляхів клітини з ензимами біогенезу КоА.

1. Методом двогібридної системи дріжджів шляхом аналізу кДНК бібліотеки ембріонів миші з використанням S6K1 як “байту” ідентифіковано S6K1-зв’язувальний білок, який згідно біоінформаційного аналізу первинної структури кДНК залучений до біогенезу КоА.

2. Вперше клоновано кДНК КоА-синтази та доведено, що вона є біфункціональним ензимом і каталізує два останні етапи біосинтезу КоА, а саме – утворення дефосфоКоА та власне утворення КоА.

3. Доведено існування взаємодії S6K1:КоА-синтаза у клітинах ссавців. З використанням делетованих форм S6K1 та КоА-синтази встановлено, що С-кінцеві ділянки цих ензимів залучені до формування білкового комплексу.

4. Методом імунофлуоресцентної мікроскопії вперше встановлено мітохондріальну локалізацію КоА-синтази. З використанням субклітинного фракціонування підтверджено асоціацію КоА-синтази з зовнішньою мембраною мітохондрій.

5. Встановлено, що мітохондріальна локалізація КоА-синтази забезпечується гідрофобним N-кінцевим доменом КоА-синтази.

6. Доведено, що взаємодія між S6K1 та КоА-синтазою не впливає на активність S6K1 та КоА-синтази.

Публікації автора:

1. Живолуп О., Немазаний І., Побігайло Н., Панасюк Г., Пальчевський С., Кухаренко О.,. Савінська Л, Овчаренко Г., Вудмаска М., Гут І., Мацука Г., Філоненко В.. Використання дріжджової двогібридної системи для пошуку S6K1 та S6K2 зв’язувальних партнерів // Біополімери і клітина. – 2002. – Т.18, №2. – С.102-109.

Особистий внесок здобувача – проведено двогібридне скринування кДНК бібліотеки ембріонів миші з використанням S6K1 як «байт», розроблено методику кількісного виміру росту дріжджових клонів, специфічність отриманих клонів перевірено методом статевого злиття.

2. Zhyvoloup A, Nemazanyy I, Babich A, Panasyuk G, Pobigailo N, Vudmaska M, Naidenov V, Kukharenko O, Palchevskii S, Savinska L, Ovcharenko G, Verdier F, Valovka T, Fenton T, Rebholz H, Wang ML, Shepherd P, Matsuka G, Filonenko V, Gout IT. Molecular cloning of CoA Synthase. The missing link in CoA biosynthesis // J. Biol. Chem. – 2002. – Vol.277, №25. – P.22107-10.

Особистий внесок здобувача – автором клоновано кДНК КоА-синтази в бактеріальні та еукаріотичні експресійні вектори, проведено біоінформаційний аналіз первинної структури отриманого клону, проведено Нозерн- та Вестерн-блот аналіз рівня експресії мРНК КоА-синтази в різних тканинах ссавців, виявлено наявність у продукті кДНК двох активностей.

3. Zhyvoloup A., Nemazanyy I., Panasyuk G., Valovka T., Fenton T., Rebholz H., Wang M. L., Foxon R., Lyzogubov V., Usenko V., Kyyamova R., Gorbenko O., Matsuka G., Filonenko V., Gout I. Subcellular localization and regulation of coenzyme A synthase // J. Biol. Chem. – 2003. – Vol.278, № 50. – P.50316-21.

Особистий внесок здобувача – отримано рекомбінантні плазміди для вивчення субклітинної локалізації КоА-синтази, проведено імунофлуоресцентний аналіз субклітинної локалізації КоА-синтази, проведено субклітинне фракціонування та аналіз фракцій лізатів клітин.

4. Zhyvoloup A., Nemazanyy I., Pobigailo N., Panasyuk G., Gout I., Filonenko V. The Use of Two-hybrid System for the identification of S6 Kinase Binding Partners // Conference for students, PhD students and young scientists on molecular biology and genetics. –Kyiv (Ukraіne), 2001. – P.157.

Особистий внесок здобувача – виконано двогібридне скринування з використанням S6K1 як «байту».

5. Zhyvoloup A., Nemazanyy I., Panasyuk G., Filonenko V., Gout I. The identification and functional characterization of novel ribosomal S6 kinase binding partner // Rev. Oncol. – 17th meeting of the Europian Association for Cancer Research. –2002. – Vol.4, Suppl. 1, P.10.

Особистий внесок здобувача - проведено двогібридне скринування з використанням S6K1 як «байту», виявлено наявність у кДНК дефосфоКоА-кіназної та фосфопантотенатаденілтрансферазної активностей у отриманого позитивного клону.

6. Filonenko V., Nemazanyy I, Panasyuk G., Zhyvoloup A., Matsuka G., Gout I.T. Identification and characterization of p70S6 kinase binding partners by yeast two hybrid system // 4th PARNAS conference Molecular Mechanisms of Cell Activation, Biological Signals and their target enzymes. – Wroclaw (Poland), 2002. –P.49.

Особистий внесок здобувача - розроблено методику кількісного виміру росту дріжджових клонів на селективних середовищах, специфічність отриманих клонів перевірено методом статевого злиття.

7. Zhyvoloup A., Nemazanyy I., Panasyuk G., Filonenko V., Matsuka G., Gout I. The use of yeast two-hybrid system for the identification of novel S6 kinase binding partners // The Ukrainian Biochemical Journal. – VIII Ukrainian Biochemical congress, . – 2002. – Vol.74, №4b, Suppl. 2. – P.30.

Особистий внесок здобувача - проведено двогібридне скринування кДНК бібліотеки з використанням S6K1 як «байту».

8. Zhyvoloup A., Nemazanyy I., Panasyuk G., Filonenko V., Gout I. CoA Synthase: a new binding partner for S6 kinase // FEBS Forum for young scientists – Istanbul (Turkey), 2002. –P.89.

Особистий внесок здобувача –біоінформаційний аналіз первинної структури отриманого клону, Нозерн-блот аналіз експресії мРНК КоА-синтази в різних тканинах ссавців, виявлено наявність у продукті кДНК дефосфоКоА-кіназної та фосфопантотенат трансферазної активностей.

9. Nemazanyy I., Zhyvoloup A., Panasyuk G., Filonenko V. Subcellular localization and regulation of CoA synthase // EJB. – FEBS Special Meeting on Signal Transduction. –2003. – Vol.270, Suppl. 1, P.142.

Особистий внесок здобувача – встановлено мітохондріальну локалізацію КоА-синтази методами конфокальної сканувальної мікроскопії та ультрацентрифугування.

10. Nemazanyy I., Panasyuk G., Zhyvoloup A., Gout I., Filonenko V. CoA synthase binds ribosomal S6 kinase 1 in vivo // Workshop on: The Proteins Controlling Cell Growth And Their Role In Tumour Formation: mTOR, TSC and PTEN.– Madrid(Spain), 2003. –P.57.

Особистий внесок здобувача – з використанням методу імунопреципітації встановлено, що КоА-синтаза специфічно взаємодіє з S6K1 в клітинах ссавців.

11. Nemazanyy I., Panasyuk G., Zhyvoloup A., Gout I., Filonenko V. CoA synthase binds ribosomal S6 kinase 1 in vivo // EJB. – 29^th FEBS Meeting. – Warsaw (Poland), 2004. – Vol.271, Suppl. 1, Р.168.

Особистий внесок здобувача - встановлено, що КоА-синтаза специфічно взаємодіє з S6K1 в клітинах ссавців in vivo. Встановлено, що ферменти не впливають на активність одне одного.