Анотація до роботи:

Герілович Антон Павлович. Хвороба Марека: індикація і вивчення біологічних властивостей та розробка засобів діагностики. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук за спеціальністю 16.00.03 – ветеринарна мікробіологія та вірусологія. Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН, Харків, 2005.

Дисертація присвячена вивченню циркуляції вірусу хвороби Марека в птахогосподарствах України, біологічних властивостей епізоотичних штамів та розробці засобів діагностики цього захворювання.

В роботі наведені результати вірусологічних досліджень з індикації збудника в птахогосподарствах України. При дослідженні 370 проб клінічного та патологічного матеріалу від курей неблагополучних з хвороби Марека господарств виділено 33 епізоотичні ізоляти, 19 з яких за результатами ПЛР ідентифіковано як першого, 6 - другого і 8 - третього серотипів ВХМ За патогенністю для курячих ембріонів і курчат виділені ізоляти І серотипу вірусу віднесені до vv-, v- та m-патотипів.

Розроблені способи виготовлення специфічних антигенів вірусу хвороби Марека з активністю до 1:512 та гіперімунних сироваток для діагностики цього захворювання в реакції дифузної преципітації. За результатами вивчення послідовності нуклеотидів гену Meq 8 патогенних та 4 вакцинних штамів І серотипу було встановлено, що ця ділянка геному вірусу є висококонсервативною для патогенних ВХМ-І. Теоретично розраховані праймери MDV-1, MDV-2, MDV-3 та MDV-4, що фланкують 321/286 п.н. ділянку, які запропоновано використовувати для детекції ДНК онкогенних штамів ВХМ І серотипу. Створена на їх основі тест-система, дозволяє виявляти у досліджуваному матеріалі вірусний геном при інфекційній активності збудника на рівні 1 ФУО/см³.

1. За результатами клініко-епізоотологічних та вірусологічних досліджень вивчено поширення, біологічні властивості та патотип епізоотичних ізолятів збудника хвороби Марека, що циркулюють серед курей у птахогосподарствах України; розроблено тест-системи для виявлення антигену ВХМ й антитіл до нього в реакції дифузної преципітації та індикації ДНК онкогенних штамів вірусу в полімеразній ланцюговій реакції.

2. Епізоотична ситуація з хвороби Марека в Україні характеризується нестабільністю, що проявляється зменшенням кількості неблагополучних осередків з 20 (1994) до 2 (2000) та поступовим її збільшенням до одинадцяти (2004 р.). В епізоотичних вогнищах спалахи хвороби Марека перебігають у гострій та класичній формах серед курей 38-200-добового віку, супроводжуються загибеллю до 45 % ураженого птахопоголів'я і мають виражену сезонність (лютий та жовтень-листопад).

3. При дослідженні 370 проб клінічного та патологічного матеріалу від курей неблагополучних з хвороби Марека господарств виділено 33 епізоотичні ізоляти, 19 з яких за результатами ПЛР ідентифіковано як першого, 6 - другого і 8 - третього серотипів ВХМ.

4. Виділені епізоотичні штами розрізняються за патогенністю для курячих ембріонів і курчат та інфекційною активністю в культурі ФЕК, яка коливається від 1200 до 100000 ФУО/см³, у залежності від локалізації в організмі ураженої птиці. Штами першого серотипу вірусу хвороби Марека спричиняють захворювання та загибель 8,5-50 % курчат і відхід до 100 % (Alexandrovsk PF і Merepha-2004) курячих ембріонів.

5. За рівнем патогенності для інтактних та вакцинованих курчат штами Borky 31/12 та Bolshevik вірусу хвороби Марека І серотипу (захворювання 10 % курчат, класична форма перебігу, стерті патологічні зміни на розтині) класифіковані як m-патотип (слабко патогенні), штам Alexandrovsk PF (захворювання та загибель по 20 %, гостра форма перебігу, лімфопроліферативні зміни в стінці залозистого шлунку) – як v- (вірулентний), a штам Merepha 2004 (за здатністю викликати в біопробі захворювання і загибель 20 % імунізованих моновакциною зі штаму FC-126 курей) - як vv- патотипи (високо вірулентний).

6. Розроблено технологію виготовлення специфічного антигену з активністю в розведеннях 1:256-1:512 для діагностики хвороби Марека в РДП і напрацювання специфічної до збудника сироватки крові шляхом гіперімунізації донорів, яка включає культивування вірусу в культурі ФЕК, дворазове заморожування-відтавання суспензії інфікованих клітин, видалення клітинного детриту центрифугуванням при 2000 об./хв впродовж 20 хвилин, фільтрування через мембрани установки АР-102, концентрування 11,5 % ПЕГ-6000 та виснаження тканинних антигенів за допомогою протифібробластної сироватки крові.

7. Розроблена схема імунізації донорів, що полягає у дво-триразовому внутрішньовенному введенні антигену з додаванням 5 % димексиду при першій ін'єкції, дозволяє отримувати специфічні до ВХМ сироватки з активністю 6-8 log₂ у РДП, що на 1-3 log₂ більше, ніж при застосуванні класичної схеми з використанням антигену на основі ПАФ, яка передбачає введення антигену з високою концентрацією білка.

8. На основі отриманих компонентів створена тест-система РДП для індикації антигену ВХМ в клінічному і культуральному матеріалі, а також специфічних до ВХМ антитіл у сироватках крові птиці та жовтках інкубаційного яйця. Активність та специфічність компонентів тест-системи доведена в міжлабораторних комісійних випробуваннях з гетерогенними антигенами вірусів ІЛТ, НХ, ІБХ, віспи і специфічними сироватками до інших збудників вірусних хвороб птиці.

9. Послідовність нуклеотидів 1020/1200 п.н. ділянки гену Meq 8 епізоотичних і 4 вакцинних штамів є висококонсервативною для патогенного вірусу хвороби Марека першого серотипу. Обчислені чотири олігонуклеотидні послідовності, які попарно фланкують ділянки довжиною 321 і 286 п.н., запропоновано використовувати як праймери для nested-ПЛР.

10. Тест-система для детекції ДНК онкогенних штамів вірусу хвороби Марека, що розроблена на основі праймерів MDV-1, MDV-2, MDV-3 та MDV-4, дозволяє виявляти ділянку геному в пробі досліджуваного матеріалу з активністю вірусу до 1 ФУО/см³, що відповідає за чутливістю світовим аналогам.

Публікації автора:

1. Stegniy B.T., Bilokin’ V.S., Gerilovich A.P. Comparative characteristics of biological properties of some field isolates and vaccine strains of Marek’s disease virus in Ukraine// Math of IV Konfer. “Biologia molekularna w diagnostyce chorob zakaznych. – Warszawa, 2003. – P.: 191-193. (Пошукачем проведені всі експериментальні дослідження, обробка даних та їх узагальнення).

2. Герілович А.П. Вивчення епізоотичного стану з хвороби Марека та її профілактики в Україні// Ветеринарна медицина, міжвід. тем. наук. збірник. - Харків, 2004. - № 83. – С. 28-31.

3. Герілович А.П. Вірус хвороби Марека (огляд літератури)// Ветеринарна медицина, міжвід. тем. наук. збірник. - Харків, 2004. - № 83. – С. 32-38.

4. Ідентифікація та визначення онкогенності вірусу хвороби Марека методом ПЛР/ Герілович А.П., Стегній Б.Т., Вербицький П.І., Білокінь В.С., Дригін В.В., Щербакова Л.О.// Ветеринарна медицина, міжвід. тем. наук. збірник. – Харків, 2004. – № 84. – С. 205-208. (Дисертантом відібраний клінічний матеріал та проведені його дослідження вірусологічними та молекулярно-генетичними методами, обробка даних та підбір літературних джерел для обґрунтування проблеми).

5. Індикація збудника хвороби Марека птиці за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР)/ Стегній Б.Т., Вербицький П.І., Білокінь В.С., Герілович А.П.// Ветеринарна медицина України. – 2004. – № 10. – С. 5-8. (Пошукач провів дослідження клінічного матеріалу від інфікованої птиці, проаналізував та узагальнив результати досліджень).

6. Білокінь В.С., Герілович А.П. Патогенність польових ізолятів вірусу хвороби Марека для курячих ембріонів// Вісник Сумського ДАУ. – Суми, 2004. – № 7(12). – 12-15. (Дисертантом проведена індикація польових штамів вірусу хвороби Марека і вивчена їх патогенність для ембріонів курей, здійснена статистична обробка та узагальнення одержаних результатів).

7. Стегний Б.Т., Белоконь В.С., Герилович А.П. Разработка средств диагностики при болезни Марека: получение антигенов, гипериммунных сывороток и IgY// Мат. междунар. научно-произв. конф. «Актуальные проблемы эпизоотологии на современном этапе». – СПб, 2004. – С.126-127. (Пошукач особисто здійснив підбір методичних прийомів з напрацювання антигенів, гіперімунних сироваток та імуноглобулінів Y, провів експериментальні дослідження і статистичну обробку одержаних даних).

8. Stegniy B.T., Gerilovich A.P. Bilokin’ V.S. The development of AGP components for Marek’s disease diagnostics// Math. Symp.“Veterinarstvo i stokarstvo u proizwodji zdrawstvevo bezbedne hrane”. – Herceg Novi, 2004. – P. 99-103. (Дисертант провів експериментальні дослідження, літературний пошук та часткове узагальнення одержаних результатів).

9. Розробка компонентів РДП для діагностики хвороби Марека/ Герілович А.П., Стегній Б.Т., Білокінь В.С., Кіприч В.В. // Ветеринарна медицина, міжвід. тем. наук. збірник. – Харків, 2005. – № 85. – 283-287. (Здобувач підібрав методичні прийоми з розробки компонентів реакції, одержання антигенів та сироваток, схеми імунізації).

10. Герілович А.П. Вивчення патогенності польових штамів вірусу хвороби Марека для курчат// Ветеринарна медицина, міжвід. тем. наук. збірник. – Харків, 2005. –№ 85. – С. 276-282.

11. Стегній Б.Т., Білокінь В.С., Герілович А.П. Методичні рекомендації щодо діагностики хвороби Марека. – Харків, 2004. – 18 с. (Пошукачем розроблені та представлені засоби лабораторної діагностики хвороби Марека).

12. Деклараційний пат. 20031210910 Україна, 7 C12N7/00 Ізолят BelGer-1 родина Herpesviridae, підродина a-Herpesvirinae, вид Gallid herpesvirus type 2, як продуцент преципітувального антигену вірусу хвороби Марека (ВХМ)/ Стегній Б.Т., Білокінь В.С., Герілович А.П., Герман В.В. (Україна); ІЕКВМ УААН . № 71207 А; Заявл. 02.12.2003; Опубл. 15.11.2004. – Бюл. №11. – 2с.

13. Деклараційний пат. 20031210923 Україна, 7 C12N7/00 Спосіб диференціації штамів та ізолятів вірусу хвороби Марека/ Стегній Б.Т., Білокінь В.С., Герілович А.П., Герман В.В. (Україна); ІЕКВМ УААН № 69088 А ; Заявл. 02.12.2003; Опубл. 16.08.2004. – Бюл. №8. – 2с.

14. Деклараційний пат. 20031210911 Україна, 7 C12N7/00 Спосіб адаптації та культивування штаму вірусу герпесу курей SBG на перещеплюваній культурі нирки зеленої мавпи (Vero)/ Стегній Б.Т., Білокінь В.С., Герман В.В., Герілович А.П., Заремба О.В. (Україна); ІЕКВМ УААН № 69085 А ; Заявл. 02.12.2003; Опубл. 16.08.2004. – Бюл. №8 – 2с.

15. Деклараційний пат. на кор. модель 20041008710 Україна, 7 C12N7/00 Спосіб одержання концентрованого цільновірионного преципітувального антигену вірусу хвороби Марека/ Стегній Б.Т., Білокінь В.С., Кіприч В.В., Герілович А.П. (Україна); ІЕКВМ УААН № 7198; Заявл. 25.10.2004; Опубл. 06.07.2005. – Бюл. №6. – 2с.

16. Деклараційний пат. на кор. модель 20040907197 Україна, 7 А61К39/00, C12N7/00 Спосіб одержання гіперімунних сироваток до вірусу хвороби Марека/ Герілович А.П., Стегній Б.Т., Білокінь В.С., Стегній М.Ю. Кіприч В.В. (Україна); ІЕКВМ УААН № 5812 ; Заявл. 15.03.2004; Опубл. 15. 03. 2005. – Бюл. №.3. – 3с.

17. Деклараційний пат. на кор. модель 20041210064 Україна, 7 C12Q1/00 Спосіб індикації ДНК патогенних штамів вірусу хвороби Марека першого серотипу/ Стегній Б.Т., Білокінь В.С., Герілович А.П. (Україна); ІЕКВМ УААН № 7889; Заявл. 07.12.2004; Опубл. 15.07.2005. – Бюл. №7. – 4с.