Анотація до роботи:

Горбенко О.М. Ідентифікація та характеристика білків-партнерів фосфатази PTEN. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.03 – молекулярна біологія. – Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, Київ, 2006.

Метою роботи було встановити нові функціональні зв’язки між фосфатазою PTEN та білками-учасниками різних сигнальних шляхів за допомогою двогібридної дріжджової системи та підтвердити виявлену в дріжджах взаємодію із використанням молекулярно-біологічних методів за умов in vitro та в системах вищих еукаріотів. За допомогою двогібридного скринування кДНК-бібліотек із використанням мутантних форм фосфатази PTEN/S370D і ДN/PTEN як «байтів» ідентифіковано 9 PTEN-зв’язувальних білків, до яких належать переносник жирних кислот FABP4 та репресор транскрипції гена аР2 білок АЕВР1. Специфічність знайдених взаємодій підтверджено за допомогою аналізу статевого злиття дріжджів. Отримано моноклональні антитіла проти FABP4 та поліклональні антитіла проти фосфатази PTEN. Доведено утворення комплексу PTEN/FABP4 in vitro. Визначено К_D міжбілкового комплексу, що становить 2,78 мкМ. Встановлено, що експресія PTEN в клітинах лінії NIH3T3L1 зростає при диференціації, що корелює із динамікою експресії FABP4. Показано можливість утворення комплексу PTEN/FABP4 в адипоцитах NIH3T3L1. Запропоновано модель функціонування фосфатази PTEN у клітинах жирової тканини.

У дисертаційній роботі за допомогою двогібридної системи дріжджів ідентифіковано низку PTEN-зв’язувальних білків, основними серед яких є AEBP1 та FABP4, залучені до регуляції розвитку жирової тканини. Альтернативними методами підтверджено можливість формування білкового комплексу FABP4-PTEN in vitro та у клітинах диференційованих адипоцитів NIH3T3L1.

1. Cтворено «байт»-конструкції, які експресують С-кінцевий фрагмент і мутантну форму фосфатази PTEN, та відповідають вимогам двогібридної системи для скринування кДНК бібліотек.

2. За допомогою двогібридної системи дріжджів здійснено скринування кДНК-бібліотек 18-денного ембріона миші, раку кишечнику людини та клітин HeLa з використанням створених «байт»-конструкцій та ідентифіковано нові PTEN- зв’язувальні білки, зокрема, AEBP1 та FABP4.

3. Білково-білкову взаємодію між фосфатазою PTEN та FABP4 доведено за допомогою статевого злиття клітин гаплоїдних дріжджів, трансформованих кДНК «байт»-конструкцій та кДНК знайдених білків-партнерів.

4. Отримано моноклональні антитіла проти білка FABP4 та поліклональні антитіла проти фосфатази PTEN.

5. Специфічність білково-білкової взаємодії між FABP4 і PTEN in vitro доведено з використанням рекомбінантних білків за допомогою поверхневого плазмонного резонансу. Визначено рівноважну константу дисоціації K_D білкового комплексу PTEN-FABP4, що становить 2,78 мкМ.

6. Показано можливість утворення специфічного комплексу між фосфатазою PTEN та переносником жирних кислот FABP4 у клітинах адипоцитів лінії NIH3T3L1 на основі результатів їхнього кофракціонування у процесі гель-фільтрації та преципітації білкових комплексів.

7. Встановлено кореляцію експресії генів FABP4 та PTEN у процесі диференціації адипоцитів.

8. Запропоновано гіпотетичну модель функціонування фосфатази PTEN у життєвому циклі клітин жирової тканини.

Публікації автора:

1. Gorbenko O, Kuznetsov V, Kukharenko O, Zhyvoloup O, Panasyuk G, Nemazanyy I, Filonenko V, Gout I. Identification of novel binding partners for tumour suppressor PTEN by a yeast two-hybrid approach // Experimental Oncology. - 2004.- Vol.26, N1. – P.15-19. Особистий внесок здобувача - автором проаналізовано експресію сконструйованих «байт»-конструкцій у клітинах дріжджів, скринування кДНК бібліотек, перевірку виділених позитивних клонів методом статевого злиття дріжджів, секвенс-аналіз отриманих позитивних клонів.

2. Gorbenko O, Filonenko V, Gout I. Generation and characterization of monoclonal antibodies against FABP4 // Hybridoma (Larchmt). – 2006. – Vol.25, N2. – P.86-90. Особистий внесок здобувача - автором проімунізовано мишей, отримано гібридомні клони, проаналізовано властивості моноклональних антитіл, афінну очистку моноклональних антитіл із асцитної рідини.

3. Горбенко О. М., Панайотоу Дж., Волкова Д. Д., Живолуп О. М., Кухаренко О. П., Гут І .Т., Філоненко В.В. Ідентифікація взаємодії переносника жирних кислот білка FABP4 з фосфатазою PTEN // Біополімери і клітина. – 2006. – Т.22, №3. – С. 217-224. Особистий внесок здобувача - автором проскриновано кДНК бібліотеки ембріона миші, перевірено позитивні клони за допомогою методу статевого злиття клітин дріжджів, проведено аналіз експресії FABP4 та PTEN під час диференціації адипоцитів, перевірено можливість взаємодії PTEN-FABP4 методом преципітації білкових комплексів за допомогою рекомбінантних GST-злитих білків.

4. Kukharenko O.P., Kuznetsov V.V., Gorbenko O.M. Identification of new partners of tumor suppressor PTEN using LexA-based yeast two-hybrid system // Abstract Book: Conference for Students, PhD-students and young scientists on Molecular Biology and Genetics, dedicated to the golden jubilee of the doble helix and 30 anniversary og the Institute of Molecular Biology and Genetics of NAS of Ukraine. – Kyiv. –2003. – P.173. Особистий внесок здобувача - автором проаналізовано експресію химерних білків у клітинах дріжджів.

5. Gorbenko O. M., Kukharenko O.P., Volkova D.D., Filonenko V.V., Gout I.T. Identification of a novel PTEN-binding partner // VII Міжнародна конференція молодих онкологів «Сучасні проблеми експериментальної і клінічної онкології». – Київ (Україна). – 2006. – С. 90. Особистий внесок здобувача - автором проскриновано кДНК бібліотеки раку кишечнику людини, проведено секвенс-аналіз виділених позитивних клонів.

6. Gorbenko O. Report on a specific project “The use of a yeast two-hybrid screen for the search of PTEN binding partners and characterization of their biological significance”. LICR, UK. // EACR Newsletter. – 2004. – P.23. Особистий внесок здобувача - автором проскриновано кДНК бібліотек за допомогою двогібридної дріжджової системи та визначено нуклеотидну послідовність ідентифікованих клонів.