Анотація до роботи:

Стасик О. Г. Ідентифікація нових генів, що беруть участь у катаболітній регуляції у метилотрофних дріжджів Hansenula polymorpha. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.11 – клітинна біологія, цитологія, гістологія. – Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, Київ, 2008.

У дисертації подано результати генетичного, молекулярно-біологічного та ультраструктурного дослідження мутантів H. polymorpha з делетованими генами НрHXS1, НрHXT1, НрMIG1 та НрMIG2. Білкові продукти генів НрHXS1 та НрHXT1 є гомологами транспортерів та сенсорів гексоз інших видів дріжджів. Надекспресія HpHxt1, але не НрHxs1, у мутанта S. cerevisiae, не здатного до транспорту гексоз, відновлює транспорт глюкози та фруктози. Індукція експресії низькоафінного транспортера НрHxt1 у H. polymorpha є залежною від функціонування нетранспортуючого сенсора НрHxs1. С-кінцевий цитоплазматичний домен НрHxs1 є необхідним для передачі глюкозного сигналу, а точкова мутація R203K конвертує цей сенсор в конститутивно сигналізуючу форму.

Два гомологи катаболітного репресора Mig1 у H. polymorpha не є основними елементами шляху передачі глюкозного сигналу до промоторів репресибельних генів. Однак, делеція НрMIG1 та НрMIG2 впливає на тип пексофагії, пошкоджуючи макропексофагію та індукуючи мікропексофагію.

В результаті виконаної роботи ідентифіковано нові гени НрHXS1, НрHXT1, НрMIG1 та НрMIG2 метилотрофних дріжджів H. polymorpha та досліджено їх функцію в механізмах катаболітної регуляції.

Головні наукові та практичні результати викладені у наступних висновках:

1. Ідентифіковано два нових гомологи транспортерів гексоз у метилотрофних дріжджів H. polymorpha: НрHxs1 – нетранспортуючий мембранний сенсор гексоз та НрHxt1 – функціональний низькоафінний транспортер глюкози, сконструйовано та охарактеризовано мутанти з делеціями відповідних генів.

2. Встановлено, що надекспресія HpHxt1, але не НрHxs1, у hxt null мутанта
S. cerevisiae, не здатного до транспорту гексоз, відновлює транспорт глюкози та фруктози. Регуляція експресії НрHxt1 та інших транспортерів гексоз у H. polymorpha є залежною від функціонування НрHxs1 (індукція) та, раніше ідентифікованого іншого потенційного сенсора глюкози, НрGcr1 (репресія).

3. С-кінцевий цитоплазматичний домен НрHxs1 є функціонально необхідним для передачі глюкозного сигналу, а точкова мутація R203K конвертує цей сенсор в конститутивно сигналізуючу форму, що є типовим для нетранспортуючих сенсорів гексоз. Отже, H. polymorpha виявляє класичний механізм індукції транскрипції транспортерів гексоз за участю нетранспортуючого сенсора НрHxs1.

4. НрGcr1 бере участь у транскрипційній регуляції глюкозою, а його делеція призводить до пошкодження індукції пероксисомної алкогольоксидази метанолом. Точкова мутація R165K конвертує білок НрGcr1 у форму, що генерує конститутивний сигнал репресії.

5. Пошкодження потенційних сенсорів НрGcr1 та НрHxs1 не впливає на механізм катаболітної інактивації (пексофагії) пероксисомних білків. Делеція НрMIG1 та НрMIG2 впливає на тип пексофагії в H. polymorpha, пошкоджуючи макропексофагію.

6. Встановлено, що два імовірні гомологи катаболітного репресора Mig1, а також гомолог загального репресора Tup1, в H. polymorpha не є основними елементами шляху передачі сигналу глюкозної репресії до промоторів репресибельних генів. Отже, молекулярний механізм катаболітної репресії в H. polymorpha є відмінним від класичного шляху репресії у пекарських дріжджів S. cerevisiae.

7. Отримано мутантні штами H. polymorpha з пошкодженою глюкозною репресією (ЕАО2, ЕАО172), в тому числі генетично визначені (Dgcr1Dhxs1), для продукції гетерологічних білків, зокрема грибної глюкозооксидази, під промотором гену HpMОX1 у середовищі з глюкозою, які не вимагають токсичного легкозаймистого метанолу для індукції синтезу білкових продуктів.

Публікації автора:

1. Регуляція вуглецевими субстратами промотора гену алкогольоксидази у мутантів дріжджів Hansenula polymorpha з пошкодженою катаболітною репресією /
   О. Г. Стасик, О. В. Стасик, А. А. Сибірний // Біополімери і клітина. – 2002. – Т. 18, № 2 – С. 155-161.

2. A hexose transporter homologue controls glucose repression in the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha / O. V. Stasyk, O. G. Stasyk, J. Komduur, M. Veenhuis, J. M. Cregg, A. A. Sibirny // J. Biol. Chem. – 2004. – V. 279, N 9. – P. 8116-8125.

3. Glucose-induced production of recombinant proteins in Hansenula polymorpha mutants deficient in catabolite repression / O. S. Krasovska, O. G. Stasyk, V. O. Nahorny, O. V. Stasyk, N. Granovski, V. A. Kordium, O. F. Vozianov, A. A. Sibirny // Biotech. Bioeng. – 2007. – V. 97, N 4. – P. 858-870.

4. The role of Hansenula polymorpha MIG1 homologues in catabolite repression and рexophagy / O. G. Stasyk, T. van Zutphen, H. Ah Kang, O. V. Stasyk, M. Veenhuis,
   A. A. Sibirny // FEMS Yeast Res. – 2007. – V. 7, N 7. – P. 1103-1113.

5. Identification of hexose transporter-like sensor HXS1 and functional hexose transporter HXT1 in the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha / O. G. Stasyk, M. M. Maidan,
   O. V. Stasyk, P. Van Dijck, J. M. Thevelein, A. A. Sibirny // Eukar. Cell. – 2008. – V. 7, N 4. – P. 735–746.

6. Mutants of the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha deficient in glucose repression as hosts for production of alcohol oxidase and heterologous proteins : Abstracts of X Internat. Symp. Yeasts / O. V. Stasyk, O. M. Moroz, M. M. Maidan, O. G. Stasyk, A. R. Kulachkovsky, M. V. Gonchar, J. M. Cregg, A. A. Sibirny. – Arnhem (The Netherlands), 2000. – P. 159.

7. Hexose transporter/sensor homologue is involved in catabolite repression of peroxisome biogenesis in Hansenula polymorpha : Abstracts of XXI Special. Symp. Yeasts / O. V. Stasyk,
   A. R. Kulachkovsky, O. G. Stasyk, M. Veenhuis, J. M. Cregg, A. A. Sibirny. – Lviv, 2001. –
   P. 21.

8. Bioanalytical aplication of enzymes from methylotrophic yeast : Abstracts of XXI Special. Symp. Yeasts / V. А. Sibirny, M. M. Maidan, H. M. Pavlishko, O. G. Stasyk, O. V. Smutok,
   S. Stel’maschuk, M. V. Gonchar, A. A. Sibirny. – Lviv, 2001. – P. 84.

9. Mutants of the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha as hosts for production of alcohol oxidase and heterologous proteins : Abstracts of Bio-Forum II / O. V. Stasyk,
   O. M. Moroz, M. M. Maidan, O. G. Stasyk, A. R. Kulachkovsky, M. V. Gonchar, J.M. Cregg,
   A. A. Sibirny. – Lodz (Poland), 2001. – P. 96.

10. Signalling for glucose repression in methylotrophic yeast Hansenula polymorpha involves hexose transporter/sensor homologue : Abstracts of 1^st Ukr. Congr. Cell Biol. / O. V. Stasyk,
    O. G. Stasyk, J. Komdur, M. Veenhuis, J. Cregg, A. A. Sibirny. – Lviv, 2004. –– P. 15.

11. The methylotrophic yeast Hansenula polymorpha exhibits a unique molecular mechanism for glucose sensing and repression : Abstracts of 5^th Parnas Conf. Moleс. Mech. Cell. Signal. /
    O. G. Stasyk, O. V. Stasyk, M. M. Maidan, J. M. Thevelein, J. M. Cregg, A. A. Sibirny. – Kyev, 2005. – P. 37.

12. Sugar trnasporter homologues are involved in signaling for catabolite repression but not for autophagy in the yeast Hansenula polymorpha : Abstracts of 6^th Parnas Conf. Moleс. Mech. Cell. Signal. / O. V. Stasyk, O. G. Stasyk, O. S. Krasovska, A. A. Sibirny. – Krakow (Poland), 2007. – P. 8.