Анотація до роботи:

Панасюк Г.Г. Функціональна взаємодія кінази S6 рибосомного білка S6K1 та протеїнкінази 2. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.03 – молекулярна біологія. - Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, Київ, 2006.

Метою дослідження було ідентифікувати нові білки-партнери кінази рибосомного білка S6 із використанням методу двогібридної системи дріжджів та проаналізувати функціональний зв'язок виявлених взаємодій у клітині. Вперше розроблено високоефективной метод трансформації клітин дріжджів з їхнім вирощуванням у напіврідкому середовищі. Ідентифіковано 8 нових S6K1-зв’язувальних білків, шляхом аналізу кДНК бібліотеки клітин лінії HeLa, з використанням мутантної форми S6K1 Т412D як “байту”. Одним із S6K1-зв’язувальних білків ідентифіковано регуляторну субодиницю казеїн кінази 2. Отримано моноклональні антитіла проти рекомбінантної СК2b. Доведено існування комплексу S6K1-CK2b in vitro. Вперше показано, що S6K1 здатна утворювати комплекс in vivo не лише з регуляторною субодиницею СК2, а і з каталітичними - СК2a та a. Ідентифіковано новий сайт фосфорилювання у складі S6K1 – Ser17, який СК2 здатна фосфорилювати in vitro. Встановлено, що субклітинна локалізація S6K1 змінюється у відповідь на дію ростових факторів, при цьому фосфорилювання СК2 Ser17 у складі S6K1 відіграє провідну роль у регуляції експорту S6K1 з ядра клітини. Запропоновано модель регуляції ядерно-цитоплазматичного CRM1-залежного транспорту S6K1 за участі ростових факторів.

У дисертаційній роботі методом двогібридної системи дріжджів ідентифіковано S6K1-зв’язувальний білок – регуляторну субодиницю СК2. Встановлено, що СК2 залучена до регуляції субклітинної локалізації S6K1 шляхом фосфорилювання Ser 17.

1. Розроблено високоефективной метод трансформації дріжджових клітин з їхнім вирощуванням у напіврідкому середовищі.

2. Методом двогібридної системи дріжджів шляхом аналізу кДНК бібліотеки клітин лінії HeLa, з використанням мутантної форми S6K1 Т412D як “байту”, ідентифіковано 8 нових S6K1-зв’язувальних білків.

3. Доведено існування комплексу S6K1-CK2b in vitro. Встановлено, що S6K1 здатна утворювати комплекс in vivo не лише з регуляторною b субодиницею СК2, а і з каталітичними - СК2a та a.

4. Встановлено, що Ser 17 у S6K1 є специфічним сайтом фосфорилювання СК2 in vitro.

5. Отримано моноклональні антитіла проти рекомбінантної СК2b експресованої в клітинах бактерій.

6. Методом імунофлуоресцентної мікроскопії встановлено, що фосфорилювання Ser 17 у S6K1 опосередковане СК2 призводить до активації експорту S6K1 з ядра клітин.

7. Запропоновано модель регуляції ядерно-цитоплазматичного CRM1 залежного транспорту S6K1 за участі ростових факторів.

Публікації автора:

1. Panasyuk G., Nemazanyy I., Filonenko V., Zhyvoloup A. Large-scale yeast transformation in low-percentage agarose medium // BioTechniques.- 2004.- Vol. 36, №1.- P.40-44.Особистий внесок здобувача – розроблено та протестовано модифіковану методику великомасштабної трансформації з подальшим вирощуванням клітин у напіврідкому агарозному середовищі.

2. Panasyuk G., Nemazanyy I., Ovcharenko G., Lyzogubov V., Gout I., Filonenko V. Generation and characterization of monoclonal antibodies to protein kinase 2 (CK2) beta subunit // Hybridoma.- 2005.- Vol. 24, №4.- P.206-210. Особистий внесок здобувача – автором клоновано СК2 у вектор для бактеріальної експресії pET42a, очищено рекомбінантний білок CK2-6His-GSТ та 6His-GSТ, отримано моноклональні антитіла проти СК2 та 6His-GSТ та протестовано їх в імуноферментному аналізі, імуноблотингу та імунопреципітації.

3. Панасюк Г.Г., Немазаний І.О., Живолуп О.М., Філоненко В.В., Гут І.Т. Бета субодиниця казеїн кінази 2 як новий зв’язувальний партнер кінази рибосомного білка S6 // Біополімери і клітина. – 2005. – Т.21, №5. – С.407-412. Особистий внесок здобувача – автором проведено дріжджове двогібридне скринування з використанням S6K1 T412D як байту. Показано фосфорилювання повнорозмірної S6K1 рекомбінантною СК2 в умовах реакції in vitro. Ідентифіковано сайт фосфорилювання СК2 у складі S6K1 в умовах реакції in vitro. Отримано точковий мутант S6K1 S17A, та показано, що Ser 17 є основним сайтом фосфорилювання СК2 у складі S6K1 in vitro. Підтверджено взаємодію між СК2 та S6K1 в умовах in vitro.

4. Панасюк Г.Г., Немазаний І.О., Живолуп О.М., Філоненко В.В., Гут І.Т. Регуляція субклітинної локалізації кінази рибосомного білка S6 казеїнкіназою 2 // Біополімери і клітина. – 2006. – Т.22, №1. – С.82-84. Особистий внесок здобувача – автором підтверджено утворення комплексу між СК2 та S6K1 in vivo та існування регульованого ростовими факторами ядерно-цитоплазматичного транспорту S6K1. Показано, що фосфорилювання Ser 17 S6K1, опосередковане СК2, залучене до регуляції crm1-залежного експорту S6K1 з ядра. Запропоновано модель регуляції ядерно-цитоплазматичного crm1-залежного транспорту S6K1 за участі ростових факторів.

5. Zhyvoloup A., Nemazany I., Panasyuk G.,Filonenko V., Matsuka G., Gout I. The use of yeast two-hybrid system for the identification of novel S6 kinase binding partners // Український біохімічний журнал. Матеріали VIII-го Українського біохімічного з’їзду. – Чернівці (Україна). - 2002. – Vol.74, №4b. Suppl.2. – P.30. Особистий внесок здобувача – автором створено та протестовано панель байт конструкцій S6K1, включно з активованою, інактивованою та S6K1 дикого типу.

6. Panasyuk G., Zhyvoloup A., Nemazanyy I., Gout I. Yeast two hybrid system search by activated forms of S6 ribosomal kinase // EJB. – FEBS Special Meeting 2003 on Signal Transduction. – Brussels (Belgium). – 2003. – Vol.270, Suppl. 1. – P.195. Особистий внесок здобувача – автором проведено двогібридне скринування кДНК бібліотеки клітинної лінії HeLa байтом активованої форми S6K1 Т412D, ізольовано 19 позитивних клонів, які підтверджені методом статевого злиття та ідентифіковані секвенсом.

7. Panasyuk G., Nemazanyy I., Zhyvoloup A., Filonenko V., Gout I. Regulation of ribosomal S6 kinase by casein kinase 2 // 4^th Dubrovnik Signalling Conference. – Dubrovnik (Croatia), 2004. – P.142. Особистий внесок здобувача – автором методом дріжджової двогібридної системи із використанням модифікованої методики трансформації клітин дріжджів проскриновано кДНК бібліотеку клітинної лінії HeLa байтом S6K1 Т412D, підтверджено методом статевого злиття та секвеновано 25 позитивів. Як новий зв’язувальний білок S6K1 було виявлено СК2b. Показано фосфорилювання S6K1 рекомбінантною СК2.

8. Panasyuk G., Nemazanyy I., Zhyvoloup A., Palchevskii S., Filonenko V., Gout I. Casein kinase 2 as a novel binding partner of ribosomal S6 kinase // Abstract book of First Ukrainian Congress for Cell Biology. – Lviv (Ukraine), 2004. – P.38. Особистий внесок здобувача – автором клоновано та очищено рекомбінантний білок CK2-6His-GSТ і 6His-GSТ, підтверджено взаємодію між рекомбінантними S6K1 та CK2, а також між надекспресованими субодиницями СК2 та ендогенною S6K1.

9. Panasyuk G., Nemazanyy I., Zhyvoloup A., Filonenko V., Gout I. Regulation of ribosomal S6 kinase by casein kinase 2 // EJB. – 29^th FEBS Meeting. – Warsaw (Poland). – 2004. – Vol.271, Suppl. 1. – P.168. Особистий внесок здобувача – автором показано взаємодію між ендогенними білками S6K1 та CK2. Створено точкові мутанти S6K1 із заміною Ser 17 та продемонстровано, що активність точкових мутантів не змінюється.

10. Panasyuk G., Filonenko V., Gout I. Casein kinase 2 interacts with and regulates subcellular localization of S6K1 // FEBS Journal 30^th FEBS Congress and 9^th IUBMB Conference. – Budapest (Hungary). – 2005. – Vol.272, Suppl. 1. – P.299. Особистий внесок здобувача – автором показано, що Ser 17 у складі S6K1 є найефективнішим сайтом фосфорилювання для СК2 in vitro, фосфорилювання якого СК2 активує експорт S6K1 з ядра.

11. Panasyuk G., Nemazanyy I., Filonenko V., Gout I. Casein kinase 2 interacts with and regulates subcellular localization of S6K1 // The Ukrainian Biochemical Journal. – 5^th Parnas Conference. – Kyiv (Ukraine). – 2005. – Vol.77, №2. – P.134. Особистий внесок здобувача – автором показано, що експорт S6K1 з ядра клітини є crm1-залежним та регулюється фосфорилюванням СК2 Ser 17 у складі S6K1.