Ліннік Т.П. Фізико-хімічні фактори кріопошкоджень і кріозахисту сперматозоїдів півнів у циклі низькотемпературного консервування – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.19 – кріобіологія. – Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків – 2002.
У роботі досліджений вклад фізико-хімічних факторів кріопошкоджень, що чинять вплив на структурно-функціональний стан сперматозоїдів півнів на етапах їх кріоконсервування, і на підставі цього розроблені науково-обгрунтовані підходи до створення ефективних способів кріозахисту клітин.
Отримані порівняльні дані цитотоксичної дії на сперматозоїди півнів і кріозахистної ефективності двох гомологічних рядів хімічних сполук амідів і діолів (16 речовин). Виявлені ефективні кріопротектори в кожному з вивчених класів сполук у відношенні даного об'єкта. Запропоновані і вивчені способи зниження їх цитотоксичності. Запропоновані та обговорюються аспекти механізмів пошкоджуючої дії діолів і амідів та їх кріопротекторної активності.
Досліджено вплив осмолярності та іонної сили кріозахисного середовища на життєздатність сперматозоїдів. Визначений діапазон фізико-хімічних властивостей кріозахисного середовища, у якому клітини максимально зберігаються до і після кріоконсервування.
Досліджено вплив режимних параметрів та кінцевої температури охолодження на життєздатність сперматозоїдів. Показано, що основним фізико- хімічним фактором, що ушкоджує сперматозоїди, є температурно-осмотичний шок, який викликає руйнування акросомальних структур сперматозоїдів у діапазоні температур від –3 до –8 0С при швидкості охолодження понад 15 0С/хв.
На підставі проведених досліджень розроблений метод кріоконсервування сперми півнів та перевірена його ефективність при низькотемпературному зберіганні сперми півнів різних порід протягом 9- 10 років.
1. Методи кріоконсервування сперми півнів та рівень знань в цій області, що існують на цей час, не дозволяють ефективно використовувати генетичний матеріал високопродуктивних плідників у селекційно-племінній практиці. Тому в дисертаційній роботі проведено теоретичне узагальнення досліджень впливу фізико-хімічних факторів кріопошкоджень на структурно-функціональний стан сперматозоїдів півнів на кожному з етапів кріоконсервування: вплив кріопротекторів у залежності від умов інкубації і їх хімічної структури до заморожування, вплив складу і фізико-хімічних властивостей кріозахисного середовища, режимні параметри та кінцева температура охолодження і заморожування. Вивчена кріопротекторна активність двох гомологічних рядів амідів і діолів в залежності від їх хімічної структури. На підставі цього обґрунтовані нові аспекти механізму пошкоджень і кріозахисту клітин у циклі кріоконсервування та розроблений безвідмивний спосіб кріоконсервування сперми півнів, ефективність якого перевірена при довгостроковому низькотемпературному зберіганні сперми різних порід півнів (9-10 років).
2. Встановлено, що в ряді вивчених амідів менш цитотоксичними є ДМФА, МАЦ і ДМАЦ, у ряді діолів - ЕГ, 1,2-ПД і 2,3-БД. За ступенем збільшення рівня ушкоджень сперматозоїдів під їх впливом ці речовини розподілилися в наступній послідовності: ДМФА < МАЦ < ДМАЦ < ЕГ < 1,2-ПД < 2,3-БД. Виявлено, що морфологічні ушкодження сперматозоїдів під впливом амідів та діолів мають диференційний характер: діоли в більшому ступені ушкоджують мембрани голівок, аміди – акросомальну структуру клітин.
3. Показано, що рівень ушкоджень сперматозоїдів під впливом діолів та амідів по-різному залежить від температури інкубації. Кількість сперматозоїдів з морфологічними аномаліями в присутності амідів з підвищенням температури інкубації монотонно збільшується, у той час як під впливом діолів - досягає максимуму при 15 0С і зменшується з подальшим ростом температури.
4. Виявлено, що цитотоксична дія діолів на сперматозоїди залежить від розмірів їх молекул - чим більший об’єм молекул ізомерів бутандіолу або пропандіолу, тим вища їх цитотоксичність. Цитотоксична дія амідів на сперматозоїди на відміну від діолів виявляється тільки при високій температурі і концентрації і не залежить від розмірів їх молекул. Отримані дані вказують на те, що механізм цитотоксичної дії амідів і діолів на сперматозоїди відрізняється: в загальну цитотоксичну дію амідів основний вклад вносить хімічна (чи біохімічна) компонента, у той час як цитотоксичність діолів переважно обумовлена осмотичним фактором.
5. Встановлено, що при кріоконсервуванні сперми півнів кращими кріопротекторами в рядах амідів і діолів є менш цитотоксичні речовини. За ступенем зменшення кріопротекторної активності речовини розподіляються в такій послідовності: ДМФА > ДМАЦ > 1,2 –ПД > МАЦ > ЕГ > 2,3-БД. ДМФА за своєю кріозахисною активністю перевершує всі досліджені речовини, забезпечуючи відновлення функціонально повноцінних сперматозоїдів після заморожування-відтавання на 15-40 % більше ніж інші вивчені кріопротектори.
6. Визначено, що білкові добавки до кріозахисного середовища знижують цитотоксичну дію дизаміщених амідів як до, так і після заморожування-відтавання. Ефективність дії білків залежить від їх концентрації в середовищі, яка не повинна перевищувати 0,5 % для одержання високої життєздатності сперматозоїдів після кріоконсервування.
7. Виявлено, що сперматозоїди півнів стійкі до зміни осмотичності позаклітинного середовища в діапазоні від 150 до 600 мОсмоль. При цьому зниження рухливості, що спостерігається в області гіпертонії від 600 до 800 мОсмоль, є оборотним, рухливість клітин відновлюється при переносі в ізотонічні умови. Установлено, що критична осмотичність середовища для сперматозоїдів півнів в області гіпотонії, при якій 50 % клітин мають ушкоджену акросому, є 70 мОсмоль.
8. Показано, що осмотичність є одним з домінуючих фізико-хімічних параметрів кріозахисного середовища для успішного кріоконсервування сперматозоїдів, її оптимальне значення знаходиться в області помірної гіпертонії стосовно плазми сперми і становить 395-400 мОсмоль. Уперше визначено оптимальне значення іонної сили кріозахисного середовища, що складає 0,200 ± 0,017 моль/л.
9. Виявлені три критичні температурні зони дії основних факторів кріопошкоджень сперматозоїдів півнів у процесі заморожування: від –3 до –8 0С; від –15 до –25 0С; від –60 до –80 0С. Показано, що рівень ушкоджень сперматозоїдів півнів (акросом, мембран і зниження рухливості) у цих температурних зонах залежить від швидкості охолодження. При швидкості охолодження менше ніж 10 0С/хв основна частина клітин пошкоджується в області температур від –15 до –25 0С, при швидкості охолодження вище 15 0С/хв - у діапазоні від –3 до –8 0С, при цьому спостерігаються, головним чином, порушення акросомальной структури сперматозоїдів.
10. Залежність ушкоджень акросомальной структури сперматозоїдів в області температур від –3 до –8 0С, що виявлена при збільшенні швидкості охолодження вище 15 0С/хв, свідчить про те, що основним пошкоджуючим фізико-хімічним фактором для сперматозоїдів є температурно-осмотичний шок. Наслідки його впливу у цьому діапазоні температур зменшуються при зниженні швидкості охолодження до 1-3 0С/хв.
11. Встановлено, що зберігання сперми півнів у глибокозамороженому стані в умовах кріобанку протягом 9-10 років не чинить негативного впливу на морфологічну збереженість і функціональну активність сперматозоїдів. Виявлено, що стійкість сперми півнів різних порід до дії низьких температур істотно розрізняється, що призводить до необхідності корегування методу кріоконсервування в кожному конкретному випадку.
Практичні рекомендації
1. Для зниження цитотоксичної дії амідів і діолів на етапі підготовки біологічних об'єктів до заморожування кріопротектори варто вводити тільки у водному розчині чи в складі кріозахисних середовищ. Введення 100 % речовин неприпустимо, тому що екзотермічний ефект їх змішання з водою, яка складає основну частину суспензій клітин, може приводити до локальних перегрівів, підвищувати температуру інкубації і викликати ушкодження клітин.
2. Враховуючи різний характер цитотоксичної дії амідів і діолів, а також різний механізм їх кріозахисної дії і проникності крізь мембрани клітин, рекомендуються наступні способи зниження їх цитотоксичності і реалізації їх потенційної кріопротекторної активності при кріоконсервуванні біологічних об'єктів: введення і інкубацію клітин з ними проводити при температурах, близьких до нуля, використовувати аміди в комбінації з діолами у співвідношенні 1:2, у кріозахисніх середовищах застосовувати білкові добавки, наприклад, альбуміни.
3. При кріоконсервуванні сперми півнів рекомендується використовувати наступні умови підготовки клітин до заморожування: температура введення та експозиції з ДМФА і ДМАЦ не повинна перевищувати 4 0С. Час експозиції до заморожування не більший 15-20 хв. Оптимальна кінцева концентрація амідів у суспензії не більша 0,75 - 1 М. Введення діолів у суспензії сперматозоїдів можна проводити при 20 0С. Час експозиції до заморожування не більший 30 хв. Оптимальна концентрація в суспензії клітин для ЕГ і 1,2-ПД - 1 М.
5. Рекомендується використовувати наступний багатоетапный режим охолодження і заморожування сперми півнів, що забезпечує відновлення максимального числа функціонально повноцінних клітин при кріоконсервуванні в пластикових ампулах чи пайєтах з кріопротектором ДМФА в концентрації 1 М: швидкість охолодження від 4 0С до –8 0С - 1-3 0С/хв; 1-2 хв витримка на плато кристалізації; далі охолодження до –25 0С зі швидкістю 25-30 0С/хв; до –80 0С зі швидкістю 65-70 0С/хв з наступним зануренням у рідкий азот.
6. Заморожування в гранулах доцільно використовувати при кріоконсервуванні сперми окремих півнів. При цьому величина необхідної температури металевої підкладки, яка гідрофобізується кремнеорганічним звологувачем ГКЖ-94, залежить від того, який кріопротектор використовується: якщо ДМАЦ чи ДМФА, температура повинна бути –140 0С, якщо використовуються кріопротектори МАЦ, ДМФА, ЕГ, 1,2-ПД чи їх комбінація, температура підкладки повинна бути –50 0С.
7. Виявлена кореляція між кріопротекторною активністю речовин і їх кріоскопічною константою дозволяє рекомендувати цю фізико-хімічну характеристику для використання в доекспериментальному скринінгу ефективних кріопротекторів у доповненні до інших показників їх гідрофільності.
Публікації автора:
Шраго М.И., Новиков, А.Н., Ханина Л.А., Линник Т. П. Криопротекторы и криоконсерванты (основные направления исследований) // Криобиология . – 1985.- вып. 3. – С. 8-13. (Запропоновано математичне моделювання залежності кріозахисної активності кріопротекторів від їх структури.)
Терещенко А.В., Артеменко А.Б., Новиков А.Н., Линник Т.П. Криоконсервирование спермы петухов // Птицеводство.- 1990. - № 43.-С.14-17. (Ідентифіковано кріопротектори, обгрунтовано їх використання, приймала участь у розробці метода кріоконсервування.)
Новиков А.Н., Кулешова Л.Г., Линник Т.П. Механизм роста кристаллов льда в модельных системах // Биофизика. – 1991. –36, № 1. – С.122-127. (Ідентифіковано кріопротектори та проведено математичне моделювання залежності біофізичного процесу, що вивчався, від фізико-хімічних параметрів кріопротекторів.)
Новиков А.Н., Вепринцев, Б.Н., Утешев В.К.,Смолихина Т.Н., Линник Т.П. Токсическое действие криопротекторов на зародышей вьюна и лягушек // Пробл. криобиологии. – 1991. - № 4. – С.16-21. (Ідентифіковано кріопротектори та їх фізико-хімічні властивості, вивчено вплив структури кріопротекторів на їх цитотоксичність.)
Сахацкий М.І., Терещенко О.В., Артеменко О.Б., Новіков О.М., Ліннік Т.П. Токсичність і кріозахисна дія деяких кріщпротекторів при заморожуванні сперми півнів // Птахівництво. – 1992.- С.20-24. (Ідентифіковано кріопротектори та їх фізико-хімічні властивості, вивчено вплив структури кріопротекторів на їх цитотоксичність.)
Новиков А.Н., Вепринцев, Б.Н., Утешев В.К.,Смолихина Т.Н., Линник Т.П. Влияние переохлаждения и криопротекторов на внутриклеточную кристаллизацию в зародышах вьюна // Пробл. криобиологии .- 1992. - № 3.- С.27-33. (Проведено математичне моделювання залежності досліджуваних процесів від структури та фізико-хімічних характеристик кріопротекторів.)
Верховская Л.З., Луговой В.И., Ханина Л.А., Голендер В.Е., Линник Т.П. Применение вычислительных методов при целенаправленном поиске новых криопротекторов // Химико-фармацевтический журн.- 1992. – 26, № 2. – С.57- 59. (Проведено вибірку кріопротекторів та їх дескриптерів для розрахунку залежності кріозахисної активності речовин від їх структури, проаналізовано одержані результати.)
Новиков А.Н., Пичугин Ю.И., Линник Т.П. Влияние криопротекторов и ряда органических добавок на процесс рекристаллизации льда в модельных системах // Пробл. криобиологии. – 1992.- № 2.-С.20 – 23. (Проведено математичне моделювання залежності досліджуваних процесів від структури кріопротекторів, проведено аналіз одержаних результатів.)
Линник Т.П. Подходы и принципы создания криозащитных сред для спермы птиц и млекопитающих // Пробл. криобиологии. – 1993. - № 4. – С.40-48.
Линник Т.П., Терещенко А.В., Артеменко А.Б. Влияние белковых добавок к криозащитной среде на сохранность спермиев петухов при криоконсервировании // Пробл.криобиологии. – 1996. - № 2.- С.35-39. (Запропоновано та експериментально доведено ідею про позитивний вплив білків у кріозахисному середовищі на життєздатність сперміїв, проведено статистичний анализ і узагальнено результати.)
Линник Т.П. Амиды алифатических кислот– эффективные криопротекторы. I. Физико-химические свойства соединений ряда амидов // Пробл. криобиологии. – 1998. - № 3. – С.21-28.
Межидов С.Х., Моисеев В.А., Линник Т.П. Влияние концентрации различных веществ на соотношение форм гемоглобина внутри эритроцитов // Вестник проблем биологии и медицины. – 1998. - № 20. – С. 62-65. (Вивчено методом УФ-спектроскопії вплив кріопротекторів на конформацію внутрішньоклітинних білків.)
Линник Т.П. Амиды алифатических кислот – эффективные криопротекторы. II. Криозащитные свойства соединений ряда амидов // Пробл. криобиологии. – 1999. - № 2. – С. 22-32.
Kopeika J.E., Bibenko O.V, Linnik T.P., Kopeika E.F.The influence of DMSO (Dimethyl sulfoxide) on the sperm genome of Misgurnus fossilis // Cryobiology.- 1999. – 39. – P. 318. (Отримано фракції ДМСО різного ступеню очистки, проведено їх ідентифікація.)
Линник Т.П., Грищенко В.И., Артеменко А.В., Терещенко А.В. Влияние осмотичности криозащитной среды на сохранность спермиев петухов при криоконсервировании // Пробл. криобиологии. – 2000. - № 2. – С.86 – 93. (Визначено діапазон осмотичності кріозахисного середовища , в якому сперматозоїди зберігають свою життєздатність до і після заморожування, проведено статистичний анализ і узагальнено результати.)
Линник Т.П., Грищенко В.И., Артеменко А.В., Терещенко А.В. Влияние длительного низкотемпературного хранения спермы петухов на ее оплодотворяющую способность // Пробл. криобиологии. – 2000. - № 3. – С. 64-71. (Доведено різницю в стійкості сперми півнів різних порід до дії низьких температур, проаналізовано одержані результати.)
Линник Т.П.. Бизикина О.В. Криоконсервирование спермы петухов.I. Цитотоксичность диолов и амидов // Пробл. криобиологии. - 2001. - № 2. – С. 72 – 79. (Вивчено цитотоксичність амідів і діолів у залежності від умов інкубації та від структури кріопротекторів, проанализовано отримані результати, запропоновано механізм їх пошкоджуючої дії)
Линник Т.П., Бизикина О.В. Криоконсервирование спермы петухов.II.Криозащитная активность диолов и амидов // Пробл. криобиологии. - 2001. - № 4. – С. 43-51. (Досліджено вплив структури амідів і діолів на їх кріозахисну активність, проведено статистичний анализ і узагальнено результати, запропоновано механізм їх дії.)
Линник Т.П., Бизикина О.В. Цитотоксичность и криопротекторная активность диолов, амидов и их смесей при криоконсервировании спермы петухов // Пробл. криобиологии. – 2001. - № 3 . – С.50. (Запропоновано ідею використання сумішей кріопротекторів на базі амідів і діолів, перевірено експериментально, проведено аналіз одержаних результатів.)
Бизикіна О.В., Артеменко О.Б., Ліннік Т.П. Використання різних класів кріопротекторів при кріоконсервуванні сперми півнів // Птахівництво. – 2001, вип.51. - С.14-18. (Запропоновано ідею використання сумішей кріопротекторів на базі амідів і діолів, перевірено експериментально.)
Бизикина О.В., Линник Т.П. Криоконсервирование спермы петухов. III. Цитотоксичность и криопротекторная активность смеси N,N-диметилформамида с диолами // Пробл.криобиологии. – 2002.- № 1. – С.39-44. (Запропоновано ідею використання суміші кріопротекторів на базі амідів і діолів, перевірено експериментально, проаналізовано одержані результати.)
Гордієнко О.І., Ліннік Т.П. Механізми проникання неелектролітів низки діолів крізь мембрани еритроцитів // Вісн. ХНУ № 568 - Біофіз. вісн. – 2002. – вип. 2(11). – С. 53-58. (Ідентифіковано кріопротектори ряду діолів та їх фізико-хімічні і структурні параметри.)
Сахацкий Н.И., Терещенко А.В., Артеменко А.Б., Новиков А.Н., Линник Т.П. Разработка защитной среды для консервации спермы петухов // Науч-техн. Бюл. УкрНИИП, Харьков, 1988.- вып.24. – С.29-32. (Проведено математичне планування оптимізації складу кріозахисного середовища.)
Пичугин Ю.И., Новиков А.Н., Линник Т.П. Зависимость цитотоксичности и криопротекторной активности диолов от их структуры и физико-химических свойств. II. Криоконсервирование спермы карпа // Сб науч. тр. «Криоконсервирование клеток и тканей», Харьков,1989. – С.21-28. (Проведено кореляцію між кріозахисною активністю діолів і їх фізико-хімічними параметрами, встановлено залежність цитотоксичності діолів від їх гідрофобності.)
Линник Т.П., Новиков А.Н., Терещенко А.В., Сахацкий Н.И., Артеменко А.Б. Криконсервирование спермы петухов на основе смеси криопротекторов амид - гликоль // Сб. науч. тр. «Патофизиологические аспекты действия холода на организм», Харьков,1989. – С.64-68. (Експериментально доведено позитивний ефект використання суміші кріопротекторів на базі амідів і діолів.)
Пичугин Ю.И., Линник Т.П. Прогноз использования ряда кетоспиртов в качестве криопротекторов // Сб.науч.тр. «Патофизиологические аспекты действия холода на организм», Харьков,1989. – С.11-15. (Вивчено залежність кріозахисної активності кетоспиртів від їх структури.)
Новиков А.Н., Линник Т.П. Влияние физико-химических свойств криопротекторов на скорость роста и размер кристаллов льда в модельных системах // Сб.науч.тр. «Физико-химические свойства и биологическое действие криопротекторов», Харьков,1990. -–С.99-103. (Проведено математичне моделювання залежності швидкості росту кристалів льоду від структури кріопротекторів.)
Новиков А.Н., Линник Т.П., Олейник С.Т., Белецкая А.В. Влияние криопротекторов и органических добавок на характеристики рекристаллизационного процесса «стеклофаза-кристалл» //Рукопись деп. в ВИНИТИ 20.11.89. № 6949-1389, 1989 – 14 с. (Проведено математичне моделювання впливу структури та фізико-хімічних властивостей кріопротекторів на процес, який вивчався.)
Атлас инфракрасных спектров криоконсервантов / Костяев А.А., Сведенцев Е.П., Гордиенко Е.А., Конопельцев И.К., Розанов Л.Ф., Нардид О.А., Линник Т.П., Останков М.В., Кротов Ю.В., Муратов В.В. – Сыктыквар: Ин-т физиологии Коми НЦ РАН, 2001.- 72 с. (Ідентифіковано кріопротектори та їх фізико-хімічні параметри, приймала участь в інтерпретації ІЧ-спектрів.)
Линник Т.П., Пичугин Ю.И. Прогнозирование эффективных криопротекторов в ряду диолов и амидов методом КССА // Тез.докл. II международ. конф. «Успехи современной криобиологии», Харьков, 1992. – С. 95-96.
Pichugin J.I., Linnik T.P., Novikov A.N., Levchenko E.N. On the mechanism of action of low and high molecular cryoprotectants // Abstr.confer. “Theoretical basis of cryopreservation”, Hrades Kralove, Czech and Slovak Federal Republic, 1992. – P. 9.
Линник Т.П., Пичугин Ю.И. Подходы и принципы создания многокомпонентных криозащитных сред для спермы птиц // Тез. докл. I съезда общества криобиологии и криомедицины, Харьков, 1995. – С. 136-137.
Пичугин Ю.И., Линник Т.П. Итоги и перспективы поиска новых эндоцеллюлярных криопротекторов // Тез. докл. I съезда общества криобиологии и криомедицины, Харьков, 1995. – С. 202 – 203.
Lugovoi V.I., Stribul T.F., Linnik T.P. The dynamics of izoenzyme amylase compound change in the endosperm of maize sprouting seeds after low temperature effect // Abstr. 34th Annual Meeting of the Society for Cryobiology.- Barcelona, 1997. – P.113.
Kopeika J.E., Bibenko O.V, Linnik T.P., Kopeika E.F..The influence of DMSO (Dimethyl sulfoxide) on the sperm genome of Misgurnus fossilis // Abstr. 36 th Annual Meeting of the Society for Cryobiology.- Marseille, France, 1999. – P. 79.
Гордієнко О.І., Ліннік Т.П. Проникність мембран еритроцитів до неелектролітів низки діолів // Тез.допов. ІІІ з’їзду Українського біофізичного товариства, Львів. – 2002.- С.116.
