Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.02 – біофизика. – Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, Київ, 2008.
Показано, що в культурі нейронів гіпокампа експресуються ванілоїдні рецептори як 1-го так і 2-го типу, при чому із застосуванням методики single-cell Real-time PCR доведено, що в культивованих нейронах гіпокампа рівень мРНК ванілоїдного рецептору 1-го типу знаходиться на значно вищому рівні, ніж мРНК ванілоїдного рецептору 2-го типу. Аналіз експресії цих рецепторів показав, що в ГАМК-ергічних нейронах експресія ванілоїдного рецептора 1-го типу значно вища, ніж експресія ванілоїдного рецептору 2-го типу, тоді як експресія цих рецепторів в глутаматергічних нейронах не відрізнялась. У роботі представлені дані нейротоксичного впливу капсаїцину на нейрони гіпокампа. Проведені експерименти показали, що при інкубації з капсаїцином (10 мкМ) кількість живих клітін складала 46,4 ± 3,3% (Р<0.05), некротичних 30,7 ± 2,4% (Р<0.05) та апоптотичних 22,9 ± 5,4% (Р<0.05). Коінкубація клітин з капсаїцином та капсазепіном (25 мкМ) забезпечувало зниження кількості апоптотичних клітин до 15,4 ± 0,4% (Р<0.05). При цьому відносна кількість клітин з некротичними змінами майже не змінювалась. З використанням конфокальної мікроскопіі було показано, що капсаїцин призводить до зниження мітохондріального потенціалу, а капсазепін нівелює цей ефект. Таким чином, отриманні дані вказують на те що цитотоксична дія капсаїцину пов’язана зі зміною мітохондріального потенціалу та опосередковується активацією ванілоїдних рецепторів 1 типу. З використанням електрофізіологічної методики «patch-clamp», досліджували спонтанні гальмівні постсинаптичні струми. При прикладанні капсаїцину (10 мкМ) спостерігалось зменшення частоти (на 70%) та амплітуди (на 80%) виникнення спонтанних гальмівних постсинаптичних струмів. При аплікаціі капсаїцину (10 мкМ) та подальшого додавання, капсазепіну (25 мкМ) спостерігалось збільшення частоти спонтанних гальмівних постсинаптичних струмів, яке пов’язано з блокуванням ефекту капсаїцину капсазепіном.
Проведені генетичні, патофізіологічні та електрофізіологічні дослідження відкривають нові можливості для вивчення властивостей ванілоїдних рецепторів та їх функціональної ролі в клітинах гіпокампа. Визначення якісних і кількісних показників функціонування ванілоїдних рецепторів з використанням зворотньої транскрипції та наступної полімеразної ланцюгової реакції, single-cell real-time PCR, методики «patch-clamp», флуоресцентної мікроскопії, конфокальної мікроскопії дозволяють комплексно оцінити як можливу фізіологічну роль даної групи рецепторів у нейронах ЦНС, так і вірогідне значення змін характеристик цих рецепторів для розвитку певних паталогічних станів.
Із застосуванням методики single-cell Real-time PCR показано, що в культивованих нейронах гіпокампа рівень експресії мРНК ванілоїдних рецепторів 1-го типу є значно вищим, ніж такий мРНК ванілоїдних рецепторів 2-го типу.
Вища експресія мРНК ванілоїдних рецепторів 1-го типу більш характерна для ГАМК-ергічних нейронів, ніж для глутаматергічних нейронів; в останніх рівні експресії TRPV1 та TRPV2 майже однакові.
Капсаїцин істотно посилує загибель клітин гіпокампа в культурі як шляхом апоптозу (22,9 ± 5,4%), так і некрозу (30,7 ± 2,4%), зменшуючи відносну кількість цитологічно нормальних клітин в дослідженних зразках у середньому до 46,4 ± 3,3%.
Антагоніст ванілоїдних рецепторів типу 1 капсазепін певною мірою обмежує капсаїцин індуковану апоптотичну загибель нейронів гіпокампа (15,4 ± 0,4%), проте не впливає на процес некрозу.
З використанням конфокальной мікроскопії встановлено, що капсаїцин призводить до зниження мітохондріального потенціалу (89,7% нейронів характерізуються низьким m), а капсазепін нівелює цей ефект (низький m спостерігався у 26,7% клітин).
Агоніст ванілоїдного рецептору 1 типу капсаїцин зменшує частоту (на 60%) і амплітуду (на 70% порівняно з контролем) спонтанних гальмівних постсинаптичних струмів в ГАМК-ергічних нейронах культури гіпокампа.
Капсазепін не тільки блокує ефект капсаїцину, але й збільшує частоту спонтанних гальмівних постсинаптичних струмів в присутності агоністу ванілоїдного рецептору 1-го типу.
Публікації автора:
Статті:
Stepanyuk A.R., Boychuk Y.A., Tsugorka T.N., Drebot Y.I., Lushnikova I.V., Pivneva T.A., Belan P.V. Estimating transmitter release rates and quantal amplitudes in central synapses from postsynaptic current fluctuations // Фізіологічний журнал. – 2004. – Т. 50, № 4. – С. 22-32. (Проведення частини досліджень, участь в обговоренні даних та їх узагальненні, написання та оформлення статті) .
Markova O., Stepanyuk A., Tsugorka T., Drebot Y., Cherkas V. and Belan P. Applicability of peak scaled non stationary fluctuation analysis to studies of inhibitory synaptic transmission in hippocampal cultures // Нейрофізіологія. – 2005. – Т. 37, № 4. – С. 379-388. (Проведення частини експериментальних досліджень, написання та оформлення статті).
Drebot I.I., Storozhuk M.V., Kostyuk P.G. An unexpected effect of capsaicin on spontaneous GABAergic IPSCs in hippocampal cell cultures // Нейрофізіологія. – 2006. – Т. 38, № 4. – С. 364-367. (Проведення експериментальних досліджень та статистичної обробки результатів, написання та оформлення статті).
Дребот Ю.И., Тумановская Л.В., Нагибин В.С., Досенко В.Е., Костюк П.Г. Гибель культивируемых нейронов гиппокампа крысы, индуцированная капсаицином // Нейрофізіологія. – 2008. – Т. 40, № 1. – С. 13-20. (Проведення досліджень, участь в аналізі даних, написання та оформлення статті).
Дребот Ю.І., Болдирев А.І., Досенко В.Є., Костюк П.Г. Експресія генів, що кодують ванілоїдні рецептори 1-го та 2-го типу в культурі нейронів гіпокампа // Фізіологічний журнал. – 2008. – Т. 54, № 1. – С. 3-9. (Проведення досліджень та опрацювання даних, участь у написанні тез та оформлення статті).
Тези доповідей:
Tsugorka T.N., Stepanyuk A.R., Drebot Y.I., Markova O.A., Cherkas V.P., Belan P.V. Relationship Between Neuronal Morphology and Inhibitory Synaptic Transmission // IBRO Advanced School of Neuroscience “Receptors, Channels, Messengers” (Ukraine, 2004). – P. 56.
Tsugorka T., Stepanyuk A., Drebot Y., Markova O., Cherkas V., Dovgan A., Belan P. Dependence of delayed inhibitory synaptic currents on neuronal morphology and dendritic synaptic localization // IBRO.CEERC.Summer School (Debrecen, 2005). – P. 45.
Belan P., Markova O., Fitzgerald D., Stepanyuk A., Tsugorka T.,
Drebot Y., Tepikin A., Burgoyne R.D. Hippocalcin as a possible messenger in site specific short-term signal transduction in the hippocampus // American Society for Neuroscience 35th Annual Meeting Washington, (USA, 2005). – P. 304.
Drebot I.I., Storozhuk M.V., Kostyuk P.G. Effect of capsaicin on spontaneous GABAergic IPSCs in hippocampal cell cultures // EBPS Workshop “Neurodegeneration; basic mechanisms of motor and cognitive dysfunctions” (Poland, 2006). – P. 557.
Drebot I.I., Storozhuk M.V., Kostyuk P.G. Unexpected еffect of capsaicin on spontaneous GABAergic IPSCs in hippocampal cell cultures // 5th Forum of European Neuroscience (Austria, 2006). – P. 34.
Drebot I.I., Storozhuk M.V., Kostyuk P.G. Influence of capsaicin on spontaneous activity of GABAergic hippocampal neurones // 8th International Congress of the Polish Neuroscience Society (Poland, 2007). – P. 26.
Drebot I.I., Dosenko V.E., Kostyuk P.G. Expression mRNA TRPV1 and TRPV2 receptors in hippocampus neurones // PENS Workshop in Mechano-transduction and Nociception (Rumania, 2007). – P. 29.
