Анотація до роботи:

Павлова М.В. Дослідження властивостей рекомбінантних одноланцюгових антитіл, специфічних до інтерферону 1b людини. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.03 – молекулярна біологія. – Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, Київ, 2009.

Дисертацію присвячено одержанню та дослідженню властивостей одноланцюгових антитіл миші, специфічних до rhIFN-1b. В результаті роботи створено та охарактеризовано імунну комбінаторну бібліотеку кДНК V-генів миші. Зі створеної імунної комбінаторної бібліотеки одержано панель ScFv проти rhIFN-1b (1, 2, 4 та 11), які з високою специфічністю і чутливістю розпізнають як нативний, так і денатурований rhIFN-1b в ELISA і не зв’язуються з його структурним та функціональним гомологом – rhIFN-2b. Показано, що одержані ScFv мають різні константи афінності (від 1,9610^-8 до 1,6910^-9 M) та різну чутливість до денатурованого rhIFN-1b. У складі V-доменів ScFv ідентифіковано V-, D- та J- генні сегменти, n-нуклеотиди, соматичні гіпермутації, а також ділянки CDR-IMGT та FR-IMGT, що дозволило пояснити відмінності у властивостях одержаних ScFv. Виявлено амінокислоти, які є перспективними мішенями для подальшого мутагенезу ScFv з метою покращення їхніх властивостей. Показано, що антиген-зв’язувальний центр кожного представника одержаної панелі ScFv проти rhIFN-1b унікальний за структурою, а послідовності, що їх кодують, є новими.

Одержано панель одноланцюгових антитіл проти rhIFN-1b. Показано, що ці антитіла мають різні константи афінності та з різною чутливістю детектують денатурований rhIFN-1b. У складі ділянок CDR3 V_Н-доменів одержаних антитіл виявлено консервативний мотив AR_P_Y із замінами у позиціях 120 (F/P) та 122 (A/N), також виявлено відмінності первинної структури V_L-доменів на рівні амінокислотних замін в певних позиціях, з якими, вірогідно, пов’язані відмінності у антиген-зв’язуючих властивостях одержаних ScFv.

1. Вперше сконструйовано імунну комбінаторну бібліотеку кДНК V-генів імуноглобулінів мишей, імунізованих rhIFN-1b.

2. З імунної бібліотеки відібрано клони E. coli, які продукують ScFv проти rhIFN-1b, тоді як для клонів E. coli, ізольованих з неімунної бібліотеки, показано низький рівень експресії та нестабільність продукування специфічних до rhIFN-1b ScFv.

3. Методом фагового дисплею з імунної комбінаторної бібліотеки одержано панель ScFv, специфічних до rhIFN-1b, константи афінності яких знаходяться у діапазоні від 1,9610^-8 до 1,69 10^-9 М. Продемонстровано стабільність одержаних ScFv при пересівах і зберіганні, високу селективність та чутливість зв’язування з нативним rhIFN-1b, а також здатність детектувати щонайменше 1,5 нг денатурованого rhIFN-1b (ScFv 1 і 4).

4. Визначено первинну структуру V_Н та V_L ScFv, специфічних до rhIFN-1b одержаних з імунної (1, 2, 4, 11) та неімунної (ScFv (naive)) комбінаторних бібліотек. Показано, що:

ДНК доменів V_H та V_L ScFv проти rhIFN-1b належать, відповідно, до першої та третьої субгрупи IMGT;

довжина ділянок CDR3-IMGT доменів V_Н та V_L ScFv, одержаних з імунної бібліотеки, складає, відповідно, 6 та 9 амінокислотних залишків, а ScFv (naive) – відповідно, 13 та 9 амінокислотних залишків;

абсолютна кількість нуклеотидних замін у ScFv 1 і 4, у порівнянні з послідовностями гермінальних генних сегментів, є вищою порівняно з ScFv 2 та 11.

5. У складі ділянок CDRH3-IMGT ScFv 1, 2, 4 та 11 виявлено консервативний мотив AR_P_Y із замінами у позиціях 120 (F/P) та 122 (A/N). Зазначені заміни, вірогідно, пов’язані з відмінностями у антиген-зв’язуючих властивостях ScFv, зокрема, з різною чутливістю розпізнавання денатурованого rhIFN-1b та його димерної форми, а також з різними К_аф. Ідентифіковані амінокислоти можуть стати перспективними мішенями для подальшого мутагенезу ScFv з метою покращення бажаних властивостей ScFv.

6. Показано, що антиген-зв’язуючі центри ізольованих з імунної бібліотеки ScFv унікальні за структурою, а послідовності, що їх кодують, є новими.

Публікації автора:

1. Створення та характеристика імунної комбінаторної бібліотеки кДНК варіабельних генів імуноглобулінів миші / М. В. Павлова, П. В. Гільчук, Я. О. Похоленко, Ю. С. Ніколаєв, В. А. Кордюм // Цитология и генетика. – 2008. – Т. 42, № 2. – С. 10-15. Особистий внесок здобувача – ПЛР-аналіз фагмідних ДНК у створеній імунній комбінаторній бібліотеці кДНК V-генів імуноглобулінів миші; рестрикційний аналіз повнорозмірних ампліконів ДНК, що кодують ScFv; афінна селекція імунної бібліотеки методом фагового дисплею та її скринування; оцінювання методом ELISA специфічності ScFv.

2. Характеристика панели одноцепочечных антител мыши против рекомбинантного интерферона 1b человека / М. В. Павлова, Ю. С. Николаев, Д. М. Иродов, В. А. Кордюм, П. В. Гильчук // Цитология и генетика. – 2008. – Т. 42, № 4. – С. 3-11. Особистий внесок здобувача – афінна селекція та скринування неімунної комбінаторної бібліотеки кДНК, ізолювання ДНК ScFv, специфічних до rhIFN-1b; експресія ScFv у в клонах E. coli з імунної та неімунної комбінаторних бібліотек, оцінювання рівня продукування ScFv до периплазми та середовища культивування E. coli методом Вестерн-блот аналізу; визначення ефективності зв’язування одержаних ScFv з нативним (методом ELISA) та денатурованим (методом Вестерн-блот аналізу) rhIFN-1b; визначення констант афінності ScFv.

3. Flyak A. I. In silico analysis of the structure of variable domains of mouse single-chain antibodies specific to the human recombinant interferon 1b / A. I. Flyak, M. V. Pavlova, P. V. Gilchuk // Цитология и генетика. – 2009. – Т. 43, № 1. – С. 56-62. Особистий внесок здобувача – ПЛР-ампліфікація та підготовка до секвенування ДНК ScFv проти rhIFN-1b, а також ScFv проти rhIFN-2b.

4. Obtaining and characterization of single-chain antibodies against recombinant human interferon 1b / M. V. Pavlova, P. V.Gilchuk, U. S. Nikolayev // Конференція молодих учених, присвячена 185-літтю Грегора Менделя, 4-5 трав. 2007 р. : тези доп., Біополімери і клітина. – 2007. – Т. 23, № 4. – С. 282. Особистий внесок здобувача – визначення стабільності експресії ScFv при пересівах та зберіганні, а також рівнів та динаміки накопичення цільових ScFv у периплазмі клонів E. coli.

5. Obtaining and characterization of single-chain antibodies of variable specificity / M. V. Pavlova, P. V. Gilchuk, U. S. Nikolayev // Modern problems of microbiology and biotechnology : The young scientist’ and students’ international scientific conference, 28-31-th May 2007. : Book of abstract. – Odesa (Ukraine), – 2007. – P. 158. Особистий внесок здобувача – оцінювання методом імуноблотингу реплік колоній ефективності збагачення імунної комбінаторної бібліотеки кДНК на ScFv проти rhIFN-1b, рестрикційний аналіз ДНК ScFv.

6. Одержання та характеристика одноланцюгових антитіл / М. В. Павлова, П. В. Гільчук, Ю. С. Ніколаєв // Актуальні проблеми біохімії та біотехнології : конференція молодих учених, 7-8 черв. 2007 р. : тези доп., Український біохімічний журнал – 2007. – Т. 79, № 4. – С. 130. Особистий внесок здобувача –дослідження стабільності ScFv при зберіганні та їхньої чутливості до протеолізу; визначення імунохімічних властивостей одержаних ScFv.

7. Obtaining and characterization of a panel of mouse single-chain antibodies from combinatorial cDNA antibody libraries / M. V. Pavlova, U. S. Nikolayev, P. V.Gilchuk // Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics, dedicated to 120^th anniversary of M.I.Vavilov : 20-22-th Sep. 2007. : Abstract book. – Kyiv (Ukraine), 2007. – P. 139. Особистий внесок здобувача – афінна селекція неімунної комбінаторної бібліотеки; оцінювання ефективності збагачення неімунної бібліотеки методом фагового ELISA та імуноблотингу реплік колоній; субклонування послідовностей ScFv-ДНК збагаченої неімунної бібліотеки у векторі рCANTAB 5E.

8. Structural analysis of the variable domains of single-chain antibodies from a combinatorial cDNA antibody library / A. I. Flyak, M. V. Pavlova, P. V. Gilchuk // Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics, dedicated to 120^th anniversary of M.I.Vavilov : 20-22-th Sep. 2007. : Abstract book. – Kyiv (Ukraine), 2007. – P. 119. Особистий внесок здобувача – узагальнення результатів іn silico аналізу структури V-доменів ScFv.

9. Аналіз структури варіабельних доменів одноланцюгових антитіл, одержаних з комбінаторної бібліотеки кДНК імуноглобулінів миші / А. І. Фляк, М. В. Павлова, П. В. Гільчук // Український біохімічний журнал – 2008. – Т. 80, № 4. – С. 173. Особистий внесок здобувача – визначення констант афінності ScFv проти rhIFN-1b.