Анотація до роботи:

Тарасов А.І. Чутливість кровотворних клітин-попередників ембріональної печінки людини до дії факторів низькотемпературного консервування. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за фахом 03.00.19 – кріобіологія. – Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків, 2003.

Дисертація присвячена проблемі консервування кровотворних клітин-попередників ембріональної печінки людини (ККП ЕПЛ). У роботі експериментально досліджені імунофенотип, життєздатність, колонієутворююча активність кріоконсервованих ККП ЕПЛ, особливості осмотичної реакції ККП ЕПЛ, а також визначені основні величини, що характеризують транспорт води і кріопротектора через мембрану ККП ЕПЛ і його залежність від температури. Показано, що вміст ККП у ЕПЛ складає близько 1%, більшість же клітин ЕПЛ відноситься до попередників еритропоезу різного ступеня комітованості. Колонієутворююча активність ККП ЕПЛ є високою: більш 60% з них утворює гемопоетичні колонії в напівтвердому середовищі, причому колонієутворюючий потенціал клітин ЕПЛ зменшується зі збільшенням терміну гестації зразка. ККП ЕПЛ піддані впливу процедури кріоконсервування в більшій мірі, ніж зрілі еритроїдні попередники, що говорить про необхідність оптимізації протоколу консервування ЕПЛ. Особливостями осмотичних характеристик CD34⁺CD38^- ККП ЕПЛ є високе значення осмотично неактивного об'єму та енергії активації транспорту ДМСО (що стандартно використовується в якості кріопротектора). Результати роботи можуть бути використані як у медичній практиці, так і для розробки протоколів консервування ККП.

Визначення чутливості кровотворних клітин-попередників ембріональної печінки людини до дії факторів низькотемпературного консервування iз поглибленим вивченням особливостей мембранного транспорту води і кріопротектора дозволяють застосувати раціональний підхід до оптимізації метода консервування суспензії клітин ембріональної печінки людини та розширюють уявлення щодо механізмів біологічної дії кріоконсервованих препаратів. Результати, отримані в дисертаційній роботі, дозволяють зробити такі висновки:

1. Досліджена чутливість гемопоетичних клітин ембріональної печінки людини 6-12-ти тижнів гестації до дії факторів низькотемпературного консервування, визначені кріобіофізичні характеристики популяції CD34⁺CD38^- клітин-попередників.

2. Імунофенотипний аналіз гемопоетичних клітин ембріональної печінки людини показав, що більшість з них являє собою еритроїдні клітини різного ступеня комітації, а вміст кровотворних клітин-попередників (CD34⁺, CD133⁺) складає близько 1%.

3. Паралельне визначення життєздатності та імунофенотипу методом багатоканальної проточної цитометрії дозволило виявити різну чутливість клітин різного імунофенотипу до низькотемпературного консервування. Показано, що після програмного триетапного кріоконсервування під захистом 5% ДМСО життєздатність клітин-попередників (CD34⁺, CD133⁺) була нижчою за життєздатність еритроїдних (Gly-A⁺) клітин.

4. Кріоконсервовані клітини ембріональної печінки людини здатні утворювати мієлоїдні колонії основних типів при культивуванні в полутвердому середовищі в присутності рекомбінантних ростових факторів. При цьому кількість колоній корелює з життєздатністю та числом експлантованих кровотворних клітин-попередників.

5. Клітини, що були отримані з печінки ембріонів людини 7-9 тижнів гестації, мають більшу колонієутворюючу активність і більшу стійкість до циклічного заморожування-відігріва у порівнянні з клітинами, що були виділені з печінки ембріонів 10-12 тижнів.

6. Застосування мікроскопічного метода дослідження осмотичної реакції та паралельного фарбування моноклональними антитілами дозволило визначити осмотичні характеристики CD34⁺CD38^- кровотворних клітин-попередників ембріональної печінки людини: осмотично неактивного об'єму, транспортних коефіцієнтів, а також енергії активації для води та ДМСО.

7. Високі значення осмотично неактивного об'єму та коефіцієнтів проникності для води і ДМСО CD34⁺CD38^- клітин ембріональної печінки людини свідчать про те, що ймовірність пошкодження CD34⁺CD38^- клітин на етапах додавання кріопротектора і заморожування є низькою. Значення енергій активації транспорта води та ДМСО через мембрану CD34⁺CD38^- клітин припускають високу ймовірність постгіпертонічного стресу на етапах відігріву та відмивання кріопротектора.

8. Згідно до теоретичних розрахунків, для уникнення постгіпертонічного лізісу діапазон швидкостей заморожування кровотворних клітин-попередників ембріональної печінки людини може бути зміщений від 1С/мин (що використовується зараз) у бік збільшення, а відмивання від кріопротектора може провадитись при кімнатній температурі.

Публікації автора:

1. Грищенко В.И., Тарасов А.И., Руденко С.В., Петренко А.Ю. Чувствительность клеток эмбриональной печени человека 7-12 недель гестации к циклическому замораживанию-отогреву// Проблемы криобиологии. - 2000. - Т. 4. - С. 37-44.

2. Тарасов А.И., Петренко А.Ю., Грищенко В.И., Джонс Д.Р.Е. Жизнеспособность и функциональная активность клеток эмбриональной печени различного фенотипа после криоконсервирования// Проблемы криобиологии. - 2002. - Т. 3. - С. 36-41.

3. Tarasov A.I., Petrenko A.Yu., Jones D.R.E., and Grischenko V.I. Phenotypic Analysis and Colony-Forming Activity of Cryopreserved Human Fetal Liver Hematopoietic Cells// Experimental Oncology. - 2002. - Vol. 24(3). - P. 180-183.

4. Тарасов А.И., Петренко А.Ю., Джонс Д.Р.Е. Осмотические характеристики кроветворных клеток-предшественников эмбриональной печени человека// Вiсник Харкiвського Нацiонального унiверситета №568: Бiофiзичний вiсник. - 2002. – Вип. 11(2). - С. 58-62.

5. Petrenko A.Yu., Sukach A.N., Mazur S.P., Tarasov A.I., Gerasimova I.G., Grischenko V.I. Cryopreserved human fetal liver cells: cryoresistance and influence to liver regeneration after partial hepatectomy in rats// Cryobiology. - 1999. - Vol. 39(4). - P. 369 (36^th Annual meeting of the Society for Cryobiology, Marseille, France, 1999).

6. Petrenko A.Yu., Tarasov A.I., Sukach A.N., Mazur S.P., Grischuk V.P., Moiseeva N.M., Ochenashko O.V., Skorobogatova N.G. Effect of Cryopreservation on the Integrity and Functional Activity of Embryonic Liver Stem Cells// Cryobiology. - 2001. - Vol. 43(4). - P. 387-388 (38^th Annual Meeting of the Society of Cryobiology, Edinburgh, Scotland, 2001).

7. Тарасов А.И., Джонс Д.Р.Е., Грищенко В.И., Петренко А.Ю. Фенотип и колониеобразующая активность криоконсервированных клеток эмбриональной печени человека// Проблемы криобиологии. – 2001. - №4. - С. 58 (Международная конференция "Успехи и перспективы развития криобиологии и криомедицины", Харьков, Украина, 2001).