Анотація до роботи:

Юкало В.Г. Білки казеїнового комплексу коров’ячого молока та продукти їх протеолізу за дії ферментів молочнокислих бактерій. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 – біохімія, Інститут біології тварин УААН, Львів, 2007.

Дисертація присвячена дослідженню білків казеїнового комплексу коров’ячого молока та продуктів їх протеолізу, які утворюються при дії ферментів молочнокислих бактерій. Розроблено схеми виділення міцел казеїну та його основних фракцій – _S1-CN, _S2-CN, -CN та -CN без використання сильних денатуруючих факторів, що дозволяє зберегти їх структуру і властивості та використовувати як субстрати для проведення протеолітичних процесів. Запропоновано ефективну методику для електрофорезу білків казеїнового комплексу, яка забезпечує ідентифікацію казеїнових фракцій відповідно до сучасної класифікації. Охарактеризовано протеолітичну активність та інші основні біохімічні показники 50 штамів різновидностей Lactococcus lаctis та 2 штамів Str. salivarius subsp. termophilus. На основі результатів дослідження закономірностей протеолізу казеїнів лактококами введений критерій для характеристики відношення активності приклітинних і внутрішньоклітинних протеаз. Критерій пропонується використовувати при відборі штамів, здатних продукувати гіркі на смак пептиди. З допомогою розробленої протеолітичної модельної системи, яка забезпечує інтенсифікацію протеолітичних процесів, показано можливість утворення казокінінів при дії протеаз окремих протеїназо-позитивних лактококів на _S1-CN та -CN фракції казеїну. Встановлено, що здатність утворювати казокініни серед штамів лактококів зустрічається рідко. Імовірність утворення казокінінів зростає за сумісної дії на казеїни протеолітичних ферментів лактококів та молокозгортальних препаратів. Запропонована модельна система для тестування протеолітичних ферментів на здатність утворювати біологічно активні пептиди під час протеолізу казеїнів. Виділені хроматографічно низькомолекулярні пептиди після протеолізу казеїнових фракцій _S1-CN та -CN вірогідно знижували артеріальний тиск у щурів із штучною реноваскулярною гіпертензією.

Проведено комплекс біохімічних досліджень, за результатами якого запропоновано гіпотезу про утворення біологічно активних пептидів у процесах протеолізу білків казеїнового комплексу ферментами молочнокислих бактерій та молокозгортальних препаратів. Експериментально доведено наявність біологічно активних пептидів (зокрема казокінінів) у продуктах протеолізу казеїну за умов розробленої протеолітичної системи. Встановлено нові шляхи утворення біологічно активних пептидів з казеїнів. Отримані результати є теоретичною основою для створення нового типу біологічно активних добавок природного походження.

1. Розроблено новий варіант анодної електрофоретичної системи (рН 7,9) з неперервним поліакриламідним гелем низької концентрації (3,375%) при наявності сечовини (4,5 М) і 2-меркаптоетанолу (5 мМ) для електрофоретичного дослідження казеїнів коров’ячого молока. Така система забезпечує розділення й ідентифікацію білків казеїнового комплексу відповідно до останньої класифікації 2004 року.

2. Виділено міцели казеїну коров’ячого молока у системі “вода – білки молока – кислий полісахарид”. Методами електронної мікроскопії, електрофорезу і фракціонування на сефарозі 2В досліджено властивості виділених міцел, їх структуру і склад. За цими властивостями вони подібні до нативних міцел молока і можуть бути використані для дослідження процесів протеолізу. Під час виділення міцел казеїну було вперше показано перехід частини молекул білків фракції -CN у полісахаридну фазу при розшаруванні системи.

3. Диференційне осадження білків казеїнового комплексу молока за умов різної розчинності казеїнових фракцій та подальша очистка їх іонообмінною хроматографією дозволили виділити з високим виходом гомогенні фракції _S1-CN та -CN. За допомогою модифікованої методики гель-фільтрації виділено гомогенні фракції -CN і -CN, а також фракцію _S1-CN з незначними домішками фракції _S2-CN. Фракцію _S2-CN виділили за вдосконаленою методикою іонообмінної хроматографії в об’ємі. На основі цих методів розроблено схему комплексного фракціонування білків молока, яка дозволяє одержати гомогенні казеїнові фракції за мінімального впливу денатуруючих чинників (екстремальні значення рН та іонної сили).

4. Охарактеризовано 52 штами бактерій, які використовують для ферментації молока (Lcc. lactis. subsp. lactis, Lcc. lactis. subsp. cremoris, Lcc. lactis. biovar. diacetylactis, Str. salivarius subsp. thermophilus), за загальною протеолітичною активністю, наявністю приклітинних протеїназ та їх типом (РІ, РІІІ), а також окремими біохімічними показниками (утворення молочної кислоти, діацетилу, ацетоїну, стійкість до NaCl та антибіотиків) й антагоністичною активністю та фагорезистентністю. За отриманими результатами запропоновано 21 штам для проведення модельного протеолізу казеїнів.

5. Встановлено, що підвищення протеолітичної активності лактококів під час росту у середовищі на основі молока залежить від фази росту, відмирання і лізису клітин та включає два етапи. На першому етапі підвищення протеолітичної активності зумовлено дією приклітинних протеїназ, а на другому – внутрішньоклітинними протеазами. Запропоновано критерій К_П для інтегральної характеристики співвідношення активностей приклітинних і внутрішньоклітинних протеолітичних ферментів у лактококів. Показано зв’язок між значенням критерію К_П і утворенням гірких на смак пептидів під час експериментального протеолізу казеїну.

6. Отримано високу концентрацію біологічно активних пептидів (до 70 мг%) у модельній протеолітичній системі, яка забезпечує умови протеолізу казеїну, що мають місце у ферментованих продуктах (температура, рН, вміст солей, лізис клітин) за дії протеолітичних ферментів лактококів та молокозгортальних ферментів. У системі використано лактококи, вирощені в молочному середовищі, а як субстрати – загальний казеїн та його фракції, виділені з максимальним збереженням структури і складу.

7. Тестування у модельній системі виділених хроматографічних фракцій пептидів з _S1-CN, _S2-CN, -CN і -CN дозволило виявити казокініни у низькомолекулярних продуктах протеолізу фракцій _S1-CN і -CN. Виявлено два штами, здатні розщеплювати казеїнові фракції з утворенням інгібіторів ангіотензин-перетворюючого ферменту. Біологічно активні пептиди в основному утворюються при поєднанні дії лактококів і молокозгортальних ферментів. Такі штами характеризуються високою активністю приклітинних протеаз (К_П<2).

8. Виділено казокініни із низькомолекулярної фракції пептидів ферментованих продуктів, які отримано при використанні штамів лактококів, здатних утворювати інгібітори ангіотензин-перетворюючого ферменту за умов модельної протеолітичної системи. Протеолітична система може бути використана для тестування штамів і ферментних препаратів на здатність утворювати біологічно активні пептиди під час протеолізу казеїнів.

9. Низькомолекулярні пептиди, виділені з фракцій казеїнів _S1-CN і -CN, які містили інгібітори ангіотензин-перетворюючого ферменту, при згодовувані щурам з реноваскулярною гіпертензією знижують у них артеріальний тиск.

10. У результаті проведених досліджень запропонована схема шляхів утворення біологічно активних пептидів у процесі ферментативного розщеплення білків казеїнового комплексу.

Практичні рекомендації

Запропонований спосіб електрофоретичного розділення білків у ПААГ рекомендується застосовувати при дослідженнях складу білків казеїнового комплексу в наукових установах і лабораторіях, діяльність яких пов’язана з вивченням та виробництвом казеїнів.

Схему виділення казеїнових міцел загального казеїну та його фракцій, яка забезпечує збереження їх структури і складу, рекомендується застосовувати при розробці способів промислового їх виділення та при дослідженні протеолітичних процесів, в яких використовується казеїн.

Розроблена модельна протеолітична система може бути використана для тестування молочнокислих бактерій та протеолітичних ферментних препаратів на здатність звільняти БАП під час протеолізу білків казеїнового комплексу молока.

Критерій К_П для інтегральної характеристики співвідношення протеолітичних ферментів залежно від їх локалізації у клітинах лактококів рекомендується застосовувати з метою виявлення штамів, здатних утворювати гіркі на смак казеїнові пептиди.

Основні публікації за темою дисертації

1. Юкало В.Г. Електрофорез білків молока // Медична хімія. – 2000. – Т. 2, № 4. – С. 79-82.

2. Юкало В.Г. Вплив продуктів протеолізу a_S1-казеїну на активність ангіотензин-перетворюючого ферменту // Укр. біохім. журнал. – 2001. – Т. 73, № 5. – С. 28-32.

3. Юкало В.Г. Гель-фільтрація білків казеїнового комплексу // Медична хімія. – 2001. – Т.3, № 2. – С. 35-38.

4. Юкало В.Г. Препаративне виділення гомогенного a_S1-казеїну // Експерим. та клін. фізіол. і біохім. – 2001. – № 4. – С. 52-56.

5. Юкало В.Г. Іоннообмінна хроматографія білків казеїнового комплексу в об’ємі // Медична хімія. – 2001. – Т.3, № 4. – С. 87-90.

6. Юкало В.Г. Інтенсифікація протеолізу a_S1-казеїну лактококами з метою одержання фізіологічно-активних пептидів // Медична хімія. – 2002. – Т. 4, № 1. – С. 33-36.

7. Юкало В.Г. Дослідження протеолізу казеїну ферментами штамів Lactococcus lactis // Наукові записки Тернопільського педуніверситету. Серія: Біологія. – 2003. – № 3-4 (22). – С. 109-113.

8. Юкало В.Г. Утворення казокінінів у модельному протеолізі a_S1-казеїну // Медична хімія. – 2004. – Т. 6, № 1. – С. 92-95.

9. Юкало В.Г. Визначення активності протеолітичних ферментів різної локалізації у штамів Lactococcus lactis // Наукові записки Тернопільського педуніверситету. Серія: Біологія. – 2004. – № 1 – 2 (23). – С. 106-110.

10. Юкало В.Г. Утворення антигіпертензивних пептидів під час протеолізу білків сиру // Медична хімія. – 2004. – Т. 6, № 2. – С. 26-29.

11. Юкало В.Г. Виділення міцел казеїнового комплексу коров’ячого молока // Біологія тварин. – 2004. – Т. 6, № 1-2. – С. 397-400.

12. Юкало В.Г., Луговий Б.Л. Характеристика методів препаративного виділення b-казеїну // Експерим. та клін. фізіолог. і біохім. – 1998. – № 3-4. – С. 26-29. (Дисертанту належить ідея, покладена в основу статті, планування та постановка експерименту, участь у диференційному осадженні -казеїну, проведення іонообмінної хроматографії і електрофорезу, аналіз результатів, написання статті).

13. Юкало В.Г., Луговий Б.Л. Протеоліз b-казеїну протеолітично-активними штамами лактококів // Експерим. та клін. фізіол. і біохім. – 2000. – № 2. – С. 45-50. (Дисертанту належить ідея, покладена в основу статті, планування та постановка експерименту, виділення -казеїну, хроматографічний та електрофоретичний аналіз казеїнів та продуктів протеолізу, визначення концентрації продуктів протеолізу, аналіз результатів, написання статті).

14. Юкало В.Г., Луговий Б.Л. Утворення антигіпертензивних пептидів при модельному протеолізі b-казеїну // Фізіол. журн. – 2000. – Т. 46, № 3. – С. 78-83. (Дисертанту належить ідея, покладена в основу статті, планування та постановка експерименту, проведення протеолізу, виділення пептидів, визначення активності ангіотензин-перетворюючого ферменту, аналіз результатів, участь у написанні статті).

15. Юкало В.Г., Луговий Б.Л. Виділення пептидних препаратів за умови комбінованої дії лактококів і молокозгортальних протеаз на b-казеїн // Експерим. та клін. фізіол. і біохім. – 2001. – № 2. – С. 21-25. // Експерим. та клін. фізіол. і біохім. – 2001. – № 2. – С. 21-25. (Дисертанту належить ідея, покладена в основу статті, планування та постановка експерименту, виділення -казеїну, участь у вирощуванні клітин лактококів, проведення протеолізу і визначення продуктів протеолізу, участь в аналізі результатів і написанні статті).

16. Юкало В.Г., Луговий Б.Л., Дольна М.М. Характеристика фізіологічних властивостей штамів Lactococcus lactis ssp. lactis // Наукові записки Тернопільського педуніверситету. Серія: Біологія. – 2000. - №2 (9). – С. 70-73. (Дисертанту належить ідея, покладена в основу статті, планування та постановка експерименту, визначення протеолітичної активності, утворення молочної кислоти, стійкості до антибіотиків, аналіз результатів, написання статті).

17. Юкало В.Г., Дольна М.М., Луговий Б.Л. Характеристика та підбір протеолітично активних штамів молочнокислих бактерій підвиду Lactococcus lactis ssp. cremoris //Наукові записки Тернопільського педуніверситету. Серія: Біологія. – 2000. – № 3 (10). – С. 83-87. (Дисертанту належить ідея, покладена в основу статті, планування експерименту, визначення протеолітичної активності, утворення молочної кислоти, стійкості до антибіотиків, аналіз результатів і написання статті).

18. Юкало В.Г., Дольна М.М., Луговий Б.Л. Дослідження фізіологічних властивостей штамів Lactococcus lactis ssp. lactis biovar. diacetylactis // Наукові записки Тернопільського педуніверситету. Серія: Біологія. – 2001. – № 1 (12). – С. 68-71. (Дисертанту належить ідея, покладена в основу статті, планування та постановка експерименту, визначення стійкості до антибіотиків та бактеріофагів, утворення молочної кислоти, аналіз результатів і написання статті).

19. Луговий Б.Л., Юкало В.Г., Гнатюк М.С. Антигіпертензивна активність олігопептидних препаратів, отриманих при протеолізі b-казеїну лактококами, у щурів з артеріальною гіпертензією // Медична хімія. – 2000. – Т.2, №3. – С. 16-19. (Дисертанту належить ідея, покладена в основу статті, планування експерименту, проведення протеолізу b-казеїну, виділення пептидних препаратів, визначення артеріального тиску, участь в аналізі результатів і написанні статті).

20. Луговий Б.Л., Юкало В.Г., Гнатюк М.С. Кардіопротекторні властивості олігопептидних препаратів, отриманих у процесі протеолізу b-казеїну протеазами клітин Lactococcus lactis subsp. lactis // Проблеми екології та медичної генетики і клінічної імунології. – Київ-Луганськ-Харків: ЛДМУ. – 2001. – Вип. 7(39). – С. 143-151. (Дисертанту належить ідея, покладена в основу статті, планування експерименту, проведення протеолізу b-казеїну, виділення пептидних препаратів, визначення артеріального тиску, участь в аналізі результатів і написанні статті).

21. Yukalo V.G. Casokinins creation during model proteolysis of a_S1-casein by protease positive strains of Lactococcus lactis ssp. cremoris // Annales Universitatis Marie Curie-Sklodowska. – 2004. – Vol. XVII. – P. 205-207.

22. Yukalo V.G. Casokinins: their generation and usage // Nutra Bayers Guide. – Milano. Italy: B5Srl. – 2004. – P. 10-12.

23. Yukalo V.G. Obtaining of casein protein complex fractions from cow milk // Nutracos. – 2005. – № 5. – P. 17-19.

24. Yukalo V.G., Luhovyy B.L. Proteolysis of a_S1- and b-casein by Lactococci // Ernahrungsforschung. – 2000. – Vol. 45, № 3. – P. 205-206. (Дисертанту належить ідея, покладена в основу статті, планування та постановка експерименту, участь в експерименті, аналізі результатів і написання статті).

25. Yukalo V.G., Luhovyy B.L. Inhibitors of angiotensin-converting enzyme in b-casein’s proteolysis products // Annales Universitatis Marie Curie-Sklodowska. – 2002. – Vol. XV. – P. 407-409. (Дисертанту належить ідея, покладена в основу статті, планування та постановка експерименту, участь в експерименті, аналізі результатів і написанні статті).

26. Юкало В.Г., Луговий Б.Л. Фізіологічно активні пептиди казеїнового походження // Медична хімія. – 2002. – Т. 4, № 4. – С. 82-92. (Дисертанту належить ідея, покладена в основу статті, аналіз літературних даних, участь в написанні статті).

27. Способ производства кисломолочного напитка: А.с.1551330 СССР, МКИ А23 С 9/13 / В.Г Юкало, Т.Л. Шуляк, М.Д. Шпарко, З.В. Василенко (СССР). – № 4431819/31; Заявлено 27.05.88; Опубл. 23.03.90, Бюл. № 11. – 6 с. (Дисертанту належить ідея, покладена в основу винаходу, участь в плануванні та проведенні експериментів, аналізі результатів та оформленні авторського свідоцтва).

28. Пат. 1470 Беларусь, МКИ А 23 С 19/032. Способ подбора молочнокислых бактерий в состав заквасок для сыров: Пат. 1470 Беларусь, МКИ А 23 С 19/032/ В.Г Юкало (Украина), Т.Л. Шуляк (Беларусь); Могилевский технологический институт. – № 1914; Заявл. 06.05.94; Опубл. 16.02.96; – 10 с. (Дисертанту належить ідея, покладена в основу винаходу, участь в експерименті, аналізі результатів та оформленні патенту).

29. Юкало В.Г. Электрофорез молочных белков // Тезисы докладов Всесоюзной конф. «Химия пищевых веществ. Свойства и использование биополимеров в пищевых продуктах». – Могилев: ИНЭОС АН СССР. – 1990. – С. 50.

30. Yukalo V.G. Inhibitors of the angiotensin – converting enzyme in a_S1-casein proteolysis products // Programme and Abstracts of 4^th Parnas conference: Molecular mechanisms of cell activation: Biological signals and their target enzymes – Wroclaw (Poland). – 2002. – P. 95.

31. Юкало В.Г. Визначення інгібіторів ангіотензин-перетворювального ферменту в продуктах протеолізу a_S1-казеїну // Матеріали VІІІ Українського біохімічного з’їду: Укр. біохім. журн. – 2002. – Т. 74, № 4б (додаток 2). – С. 204.

32. Юкало В.Г. Утворення антигіпертензивних пептидів під час модельного протеолізу a_S1- та a_S2-казеїнів // Тези доповід. установчого з’їзду Українського товариства клітинної біології. – Львів: ІБК НАН України. – 2004. – С. 375.

33. Юкало В.Г. Антигіпертензивні властивості ферментованих молочних продуктів // Тези ІІ Всеукраїнської науково-практичної конф. «Біотехнологія. Освіта. Наука». – Львів: Н.У. «Львівська політехніка». – 2004. – С. 129.

34. Юкало В.Г. Белки казеинового комплекса молока, как предшественники биологически активных пептидов // Материалы Международной конф. „Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии”. – Минск: ИМ НАН Беларуси. – 2004. – С. 264-265.

35. Юкало В.Г. Модельна протеолітична система для виділення біоактивних пептидів з білків казеїнового комплексу // Матеріали ІХ Українського біохімічного з’їду. Київ: ІБ НАН України. – 2006. – С 236.

36. Юкало В.Г., Шуляк Т.Л. Протеолиз казеинов ферментами молочнокислих бактерий // Тезисы докладов Всесоюзной конф. «Химические превращения пищевых полимеров». – Калининград: ИНЭОС АН СССР. – 1991. – С. 22.

37. Yukalo V.G., Luhovyy B.L. The obtaining of bioactive peptide material from a_S – and b - caseins // Programme and Abstracts of the 27^th European Peptide Symposium: Journal of Peptide Science – 2002 – Suppl. to. Vol. 8. – S. 185.

38. Yukalo V.G., Luhovyy B.L. The obtaining of bioactive peptide material from products of proteоlysis a_S – and b - caseins // Peptides 2002. Proc. 27^th Europ. Peptide Sympos. – Sorrento (Italy). – 2002. – P. 666- 667.

39. Yukalo V.G., Shynkaryk M.M. Native casein micelles isolation by layering in water – milk protein – pectin system // ECTS 2006. Proc. 2^nd Europ. Conf. Filtrat. Separat. – Compiegne (France). – 2006. – P. 385- 391.