Анотація до роботи:

Кіт Ю. Я. Антитіла молока і сироватки крові людини: характеристика каталітичної активності та вплив на ріст і виживання клітин. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.11 – цитологія, клітинна біологія, гістологія. – Інститут біології клітина НАН України, Львів, 2008.

Дисертація присвячена вивченню антигенної специфічності і каталітичної активності антитіл сироватки крові і молозива людини в нормі та за деяких аутоімунних захворювань, а також встановленню впливу антитіл на ріст і виживання клітин ссавців.

Встановлено, що препарати імуноглобулінів сироватки крові частини хворих на розсіяний склероз і молозива здорових жінок-породіль можуть індукувати апоптоз або стимулювати проліферацію різних клітин-мішеней in vitro.

Функціональна активність антитіл щодо клітин може бути зумовлена їхньою антигенною специфічністю і каталітичною активністю.

Із молозива породіль очищено анти-ДНК sIgA, які володіють топоізомеразною, ендонуклеазною, РНКазною і протеїнкіназною активністю. При цьому АТР, dATP інгібують нуклеазну активність анти-ДНК sIgA, а олигодезоксирибонуклеотиди стимулюють протеїнкіназну активність цих антитіл. Анти-ДНК sIgA молозива породіль із різною ефективністю індукують загибель клітин ліній Namalwa, Jurkat, L1210 і L929.

У молоці клінічно здорових жінок-породіль і у сироватці крові хворих на розсіяний склероз виявлено антигістонові sIgA- і IgG-антитіла, які каталізують гідроліз лінкерного гістону Н1. Антигістонові IgG сироватки крові хворих на розсіяний склероз можуть інтерналізуватися у клітини ліній Jurkat і L929, а також стимулювати проліферацію Т-лімфоцитів лінії Jurkat.

У молоці клінічно здорових жінок-породіль і сироватці крові хворих на системний червоний вовчак виявлено sIgA- і IgG-антитіла, які володіють ліпідкіназною і протеїнкіназною активністю. Ліпіди співвиділяються із антитілами під час їх очистки, і фосфорилюются у складі імунних комплексів у присутності [g-³²P]ATP. Гель-фільтрація у буфері, який містить 5 % діоксан, призводить до дисоціації комплексів ліпідів із антитілами і стимуляції протеїнкіназної активності імуноглобулінів.

У дисертаційній роботі вперше проведено комплексне дослідження з метою виявлення, очистки та функціональної характеристики аутологічних антитіл сироватки крові та молока людини у нормі та при деяких аутоімунних захворюваннях. Отримані дані свідчать про те, що у сироватці крові і молоці людини присутні аутологічні антитіла із антигенною специфічністю щодо клітин ссавців, здатні каталізувати деякі біохімічні реакції. Встановлено, що ці антитіла впливають на ріст і виживання клітин in vitro, причому деякі з них можуть зв’язуватися з клітинами та інтерналізуватися ними. У молозиві деяких клінічно здорових жінок-породіль присутні аутоантитіла, які за антигенною специфічністю, каталітичною активністю і за впливом на клітини ссавців подібні до аутоантитіл сироватки крові хворих на розсіяний склероз і системний червоний вовчак. Це робить їх привабливими для подальшого дослідження з огляду на можливість їхнього використання як діагностичних та прогностичних маркерів аутоімунних порушень у породіль.

1. Імуноглобуліни сироватки крові хворих на розсіяний склероз і молозива здорових жінок-породіль здатні індукувати апоптоз T-клітин лінії Jurkat або стимулювати проліферацію цих клітин in vitro. Значну цитотоксичну активність імуноглобулінів виявлено у 36 % обстежених хворих на розсіяний склероз і 44 % клінічно здорових породіль, тоді як промітогенну активність антитіл виявлено у 13,6 % хворих на розсіяний склероз і 8 % здорових породіль.

2. У молозиві 8 % обстежених жінок-породіль встановлено підвищений рівень антитіл, які володіють спорідненістю до дволанцюгової ДНК (анти-ДНК АТ), а у 48 % породіль, виявлено антитіла зі спорідненістю до гістонів ссавців (анти-гістонові АТ).

3. Розроблено комплексний підхід для виділення та аналізу антигенної специфічності та каталітичної активності аутологічних антитіл сироватки крові і молока людини. Він полягає у використанні афінної та іонообмінної хроматографії, а також гель-фільтрації за умов дисоціації імунних комплексів, і дозволяє отримати високоочищені препарати аутоантитіл певної каталітичної активності.

4. Анти-ДНК sIgA молока людини володіють рибонуклеазою активністю щодо рибосомної РНК, топоізомеразною та ендонуклеазною активністю щодо надспіралізованої і лінійної форм ДНК плазміди, а також протеїнкіназною активністю щодо власних поліпептидів і казеїну молока людини. АТР і dАТР інгібують нуклеазну активність цих sIgA-абзимів, а синтетичні дезоксирибоолігонуклеотиди стимулють протеїнкіназну активність цих антитіл.

5. Анти-ДНК sIgA молозива породіль із різною ефективністю індукують загибель імунокомпетентних клітин (лінії Namalwa, Jurkat і L1210), а також трансформованих фібробластів миші (лінія L929). За чутливістю до цитотоксичної дії цих антитіл, досліджувані лінії клітин розподіляються наступним чином: L929 > Jurkat > L1210 > Namalwa.

6. У молоці клінічно здорових жінок-породіль і сироватці крові хворих на системний червоний вовчак уперше виявлено антитіла класів sIgA і IgG, які володіють ліпідкіназною і протеїнкіназною активністю. Ліпіди співвиділяються з цими антитілами під час їхньої очистки на протеїн А-сефарозі, ДЕАЕ-фрактогелі, АТР-сефарозі і фосфорилюються у складі імунних комплексів у присутності [g-³²P]ATP. Гель-фільтрація даних антитіл у буфері, який містить 5 % діоксан, призводить до дисоціації імунних комплексів і стимуляції протеїнкіназної активності антитіл.

7. У молоці клінічно здорових жінок-породіль і у сироватці крові хворих на розсіяний склероз вперше виявлено анти-гістонові sIgA- і IgG-антитіла, які каталізують гідроліз гістону Н1. Анти-гістонові антитіла обох ізотипів гідролізують корові гістони із значно нижчою ефективністю, ніж лінкерний гістон Н1, і не гідролізують альбумін сироватки крові бика і лізоцим курячого яйця.

8. Анти-гістонові IgG-антитіла сироватки крові хворих на розсіяний склероз стимулюють проліферацію Т-лімфоцитів лінії Jurkat. Приріст кількості цих клітин порівняно з контролем складав 37 % при дії 70 мкг/мл антитіл упродовж 72 год. У той же час, анти-гістонові sIgA-антитіла молозива породіль не впливають на проліферацію Т-клітин лінії Jurkat.

9. Анти-гістонові IgG сироватки крові хворих на розсіяний склероз зв’язуються з Т-клітинами ліній Jurkat і L929, які здатні їх інтерналізувати. Взаємодія цих аутоантитіл із Т-клітинами лінії Jurkat упродовж 2 год або з клітинами лінії L929 упродовж 6 і 24 год призводить до значного їх накопичення у цитоплазмі клітин-мішеней. За таких умов анти-гістонові sIgA-антитіл молозива жінок-породіль не інтерналізуються клітинами вказаних ліній.

Публікації автора:

1. Кит Ю. Я. Фосфорилирование рецептора rsCD4 в присутствии клеток и плазмы крови человека / Ю. Я. Кит, В. А. Якубов, В. А. Рихтер, В. В. Власов // Доклады Академии Наук. — 1995. — Т. 340, № 3. — С. 412—415. (Автором визначено завдання досліджень, проведено фосфорилювання rsCD4 за участю протеїнкіназ і підготовлено статтю до друку)

2. Kit Y. Y. Phosphorylation of different human milk proteins by human catalytic secretory immunoglobylin A / Y. Y. Kit, D. V. Semenov, G. A. Nevinsky // Biochem. Mol. Biol. Int. — 1996. — V. 36, No 3. — P. 521—527. (Автором проведено виділення й аналіз протеїнкіназної активності sIgA-абзимів).

3. Кит Ю. Я. В препаратах человеческого -лактальбумина, индуцирующих апоптоз трансформированных клеток, присутствуют рибоолигонуклеотиды / Ю. Я. Кит, Е. В. Кулигина., И. В. Романникова, Д. В. Семенов, В. А. Рихтер, В. В. Власов // Доклады Академии Наук. — 1998. — Т. 360, № 3. — С. 406—408. (Автором визначено завдання досліджень, проведено аналіз досліджень і підготовлено статтю до друку).

4. Кит Ю. Я. Фосфорилирование липидов, прочно связанных с иммуноглобулином А, в препаратах антител из молока человека, обладающих протеинкиназной активностью / Ю. Я. Кит, М. В. Шипицин, Д. В. Семенов, В. А. Рихтер, Г. А. Невинский // Биохимия. — 1998. — Т. 63, № 6. — С. 852—858. (Автором визначено завдання досліджень, проведено аналіз ліпідкіназної активності sIgA молозива породіль).

5. Yakubov L. A. The extracellular domain of CD4 receptor possesses a protein kinase activity / L. A. Yakubov, Y. Y. Kit, V. A. Richter, A. Y. Andreeva, V. N. Karamyshev, C. A. Stein, V. V. Vlassov // FEBS Lett. — 1998. — V. 431, No 1. — P. 45—48. (Автором визначено завдання досліджень, проведено аналіз протеїнкіназної активності rsCD4).

6. Семенов Д. В. Иммуноглобулин G молока человека гидролизует нуклеотиды / Д. В. Семенов, Т. Г. Канышкова, Ю. Я. Кит, Д. Ю. Хлиманков, А. М. Акимжанов, Д. А. Горбунов, В. Н. Бунева, Г. А. Невинский // Биохимия. — 1998. — Т. 63, № 8. — С. 1097—1106. (За участю автора сплановано мету досліджень і проаналізовано отримані результати).

7. Nevinsky G. A. Secretory Immunoglobulin A from human milk catalyzes milk protein рhosphorylation / G. A. Nevinsky, Y. Ya. Kit, D. V. Semenov, D. Y. Khlimankov, V. N. Buneva // Appl. Biochem. Biotechnol. — 1998. — V. 75, No 1. — P. 77—91. (За участю автора сплановано завдання досліджень, проведено аналіз субстратної специфічності протеїнкіназної активності sIgA-абзимів).

8. Кит Ю. Я. Секреторные иммуноглобулины А молока человека обладают сродством к олигонуклеотидам и нуклеиновым кислотам / Ю. Я. Кит, Д. В. Семенов, Т. Г. Канышкова, Е. В. Кулигина, И. В. Романникова, О. В. Морозова, В. А. Рихтер // Биохимия. — 1999. — Т. 64, № 1. — С. 52—59. (Автором сформульовано завдання досліджень, проведено виділення АТ, підготовлено статтю до друку).

9. Кит Ю. Я. Эндогенные олигонуклеотиды молока человека и их возможная биологическая активность / Ю. Я. Кит, Е. В Кулигина, А. М. Онищенко, Л. В. Юрченко, И. В. Романникова, В. А. Рихтер, В. В. Власов // Биохимия. — 1999. — Т. 64, № 8. — С. 59—64. (Автором визначено завдання досліджень, проведено аналіз протеїнкіназної активності білків молозива породіль, підготовлено статтю до друку).

10. Кулигина Е. В. Олигонуклеотиды и олигонуклеотидсвязывающие белки спинномозговой жидкости человека / Е. В. Кулигина, А. Ю. Андреева, А. С. Могельницкий, Ю. Я. Кит, Л. А. Якубов, В. А. Рихтер, В. В. Власов // Доклады Академии Наук. — 1999. — Т. 364, № 6. — С. 832—834. (Автором розроблено схему виділення олігонуклеотидів із спинномозкової рідини людини, проведено аналіз олігонуклеотид-звязувальних білків, підготовлено статтю до друку).

11. Кит Ю. Я. Влияние нуклеиновых кислот и полисахаридов на фосфотрансферазную активность препаратов sIgA, выделенных из молока человека / Ю. Я. Кит, Д. В. Семенов, Е. В. Кулигина., В. А. Рихтер // Биохимия. — 2000. — Т. 65, № 1. — С. 59—64. (Автором визначено завдання досліджень, проаналізовано вплив чинникив на фосфотрансферазну активності sIgA молозива породіль, підготовлено статтю до друку).

12. Kit Y. Y. Human anti-DNA secretory immunglobulins A possess endonuclease activity and they are able to cause the destruction of nuclear chromatin in vitro / Y. Y. Kit, E. E. Mitrofanova, O. E. Shestova, E. V. Kuligina, I. V. Romannikova, V. A. Richter // Укр. біохім. журн. — 2000. — Т. 72, № 3. — С. 73—76. (Автором сформульовано завдання досліджень, очищені анти-ДНК sIgA і досліджено іх ДНКазну активність, підготовлено статтю до друку).

13. Gorbunov D. V. Phosphorylation of Minor Lipids of Human Milk Tightly Bound to Secretory Immunoglobulin A / D. V. Gorbunov, D. V. Semenov, M. V. Shipitsin, Yu. Yu. Kit, T. G. Kanyshkova, V. N. Buneva, G. A. Nevinsky // Rus. J. Immunol. — 2000. — V. 5, No 3. — С. 267—278. (За участю автора сформульована мета роботи і проведено аналіз результатів досліджень).

14. Kit Y. Oligodeoxyadenylate stimulates the protein kinase activity of anti-DNA sIgA from human milk / Y. Kit, E. Kuligina, D. Semenov, V. Richter // Acta Biochim. Pol. — 2002. — V. 5, No 1. — С. 291—294. (Автором сформульована мета роботи, проведено дослідження впливу олігонуклеотидів на протеїнкіназну активність sIgA-абзимів, підготовлено статтю до друку).

15. Філяк Є.З. Дослідження впливу оксиду азоту на нуклеазну активність імуноглобулінів крові здорових людей / Є. З. Філяк, В. М. Коробов, Ю. Я. Кіт // Біологія тварин. — 2002. — Т. 4, № 1—2. — С. 157—162. (Автором визначено завдання досліджень, проаналізовано отримані дані і підготовлено статтю до друку).

16. Кит Ю. Я. Фосфотрансферазная активность препаратов IgG из сыворотки крови больных системной красной волчанкой / Ю. Я. Кит, В. А. Ковалева, В. А. Рихтер // Біополімери і клітина. — 2003. — Т. 19, № 2. — С. 185—189. (Автором отримані IgG із спорідненістю до АТР і досліджено іх фосфотрансферазну активність, підготовлено статю до друку).

17. Кит Ю. Я. Взаимодействие олигонуклеотидов и АТР с препаратами sIgA, обладающими протеинкиназной активностью / Ю. Я. Кит, В. А. Якубов, Е. В. Кулигина, В. А. Рихтер // Укр. біохім. журн. — 2003. — Т. 75, № 2. — С. 63—66. (Автором отримано препарати sIgA і досліджена їх спорідненість до олігонуклеотидів і АТР, підготовлена стаття до друку).

18. Кіт Ю. Я. Метод визначення протеїнкіназної активності в поліакриламідному гелі з використанням системи двомірного розділення білків / Ю. Я. Кіт, В. А. Ковальова, Я. П. Бобак, Л. Б. Дробот // Укр. біохім. журн. — 2002. — Т. 74, № 4. — С. 129—132. (Автором розроблено метод визначення протеїнкіназної активності білків у сиворотці крові і лізатах клітин після їхнього розділення ізоелектричним фокусуванням, підготовлено статтю до друку).

19. Кит Ю. Я. Протеинкиназная активность иммуноглобулинов плазмы крови человека / Ю. Я. Кит, А. А. Ким, Н. Р. Гут, В. А. Рихтер // Укр. біохім. журн. — 2005. — Т. 77, № 3. — С. 49—55. (Автором досліджено протеїнкіназну активність різних ізотипів імуноглобулінів сироватки крові людини).

20. Кіт Ю. Я. Виділення з молока людини секреторних імуноглобулінів класу А з різною спорідненістю до ДНК та дослідження їх ДНК-гідролізуючої активності / Ю. Я. Кiт, Р. С. Стойка // Імунологія та алергологія. — 2005. —№ 1. — С. 53—55. (Автором сплановано завдання досліджень, проведено аналіз спорідненості sIgA молозива породіль до ДНК і полісахаридів, підготовлено статтю до друку).

21. Kit Yu. Ya. Comparative analysis of the similarity between primary sequenses of receptor CD4 and protein kinases / Yu. Ya. Kit // Ukrainica Bioorganica Acta. — 2005. — No 1. — P. 20—24. (Автором проведено аналіз рівня гомології між амінокислотними послідовностями рецептора CD4 і протеїнкіназ).

22. Старикович М. А., Цитотоксическая активность иммуноглобулинов плазмы крови клинически здоровых людей и больных рассеянным склерозом / М. А. Старикович, Ю. Я. Кит, М. Я. Хавунка, Т. И. Негрич, Р. С. Стойка // Цитокины и воспаление. — 2006. — Т. 5, № 4. — С. 26—31. (За участю автора сплановано завдання дослідження, проведена очистка антитіл, підготовлено статтю до друку).

23. Кіт Ю. Я. Каталітично активні антитіла (абзими) молока людини / Ю. Я. Кіт, Р.С. Стойка // Укр. біохім. журн. — 2007. — Т. 79, № 2. — С. 5—16. (Автором проведено збір та аналіз літератури, підготовлено статтю до друку).

24. Kit Yu. Ya. Secretory IgAs from human milk with affinity to mammalian DNA are capable of hydrolyzing ribosomal RNA / Yu. Ya. Kit, E. V. Kuligina, V. A. Richter. Укр. біохім. журн. — 2007. — Т. 79, № 3. — С. 8—13. (Автором проведено дослідження впливу нуклеотидів на нуклеазну активність анти-ДНК sIgA).

25. Козак М. Р. Зниження життєздатності клітин селезінки та цитотоксичної активності імуноглобулінів сироватки крові мишей за умов тривалого згодовування їм мозку великої рогатої худоби / М. Р. Козак, Д. Д. Остапів, Ю. Я. Кіт, В. В. Влізло, Р. С. Стойка // Експ. клін. фізіол. і біохім. — 2007. — № 1. — С. 11—15. (За участю автора визначено мету дослідження, проаналізовано отримані результати).

26. Козак М. Р. Індукція апоптозу та некрозу лейкемічних клітин очищеними препаратами IgG сироватки крові мишей, яким тривалий час згодовували мозок великої рогатої худоби / М. Р. Козак, В. В. Влізло, Ю. Я. Кіт, Р. С. Стойка // Біополімери і клітина. — 2008. — Т. 24, № 1. — С. 1—5. (За участю автора встановлено завдання досліджень, проаналізовано отримані дані, підготовлено статтю до друку).

27. Kit Yu. Oligodeoxynucleotides stimulate protein kinase activivity of the anti-DNA sIgA from human milk / Kit Yu., D. Semenov, E. Kuligina, V. Richter // Mechanisms of cellular signal transduction and communication : 3^rd Parnas Conf., October 14 – 18, 2000. : Abstract Book. — Lviv, 2000. — P. 101.

28. Kuligina E. Oligonucleotides and oligonucletotide-binding proteins of human extracellular fluids / E. Kuligina, Y. Kit, I. Romannikova, D. Semenov, V Richter // RNA as Terapeutic and Genomic Target : Internat. Conf., 30^th August – 2^nd September 2001. : Abstract Book. — Nоvosibirsk, 2001. — P. 17.

29. Kit Yu. Study of phosphotranspherase activity of IgG fraction possessing affinity to ATP from blood serum of humans with lupus erytromatosis / Yu. Kit, V. Kovaleva, L. Drobot // Frontiers in autoimmunity: fundamental aspects and clinical perspectives: Internat. Conf., September 8 – 18, 2002. : Abstract Book. — Keszthly, (Hungary), 2002. — P. 39.

30. Kit Yu.Ya. Comparattive analysis of primary sequence similarity between receptor CD4 and protein kinases / Yu.Ya. Kit // Установчий з’їзд Українського товариства клітинної біології, 25-28 квіт. 2004 р. : тези доп. — Львів, 2004. — C. 34.

31. Kit Yu. Ya. ATP inhibits endonuclease activity of anti-DNA sIgA from human milk / Yu. Ya. Kit, M. O. Starykovych, V. A. Richter, R. S. Stoika // Molecular mechanisms of cellular signaling : 5^th Parnas Conf., April 26-29 2005. : Український біохімічний журнал. — 2005. — T. 77, № 2 (спец. вип.) — С. 186—187.

32. Starykovych M. O. Cytotoxic activity of immunoglobulins isolated from blood serum of multiple sclerosis / M. O. Starykovych, M. A. Khavunka, T. I. Nehrych, Yu. Ya. Kit, R. S. Stoika // Molecular mechanisms of cellular signaling : 5^th Parnas Conf., April 26-29 2005. : Український біохімічний журнал. — 2005. — T. 77, № 2 (спец. вип.) — C. 238—239.

33. Кіт Ю. Я. Каталітично активні антитіла (абзими) молока людини і деякі механізми регуляції їх активності / Ю. Я. Кіт, Р. С Стойка // IX Український біохімічний з'їзд, 24-27 жовт. 2006 р. : тези доп. — Х., 2006 — Т.1. — С. 20.

34. Кіт Ю. Я. Цитотоксична активність sIgA-абзимів молока людини / Ю. Я. Кіт, М. О. Старикович // IX Український біохімічний з'їзд, 24-27 жовт. 2006 р. : тези доп. — Х., 2006 — Т.1. — С. 45.

35. Kit Yu. Ya. Colostrum antibodies as potential markers of autoimmune disoders in parturient women / Yu. Ya. Kit, M. O. Starykovych, R. O. Bilyy, N. R. Skorohyd, V. A. Richter,. L. B. Yanyv, R. S. Stoika // Basic Science for Medicine : 3^rd Internat. Conf., September 2 – 8, 2007. — Novosibirsk, 2007. — С. 129.

36. Кіт Ю. Я. Функціональна активність автологічних антитіл в нормі та при деяких автоімунних захворюваннях / Ю. Я. Кіт // ІІ з’їзд Українського товариства клітинної біології, 23 – 26 жовт. 2007 р. : тези доп. — К., 2007. — С.196.

37. Старикович М. О. // Антигенна специфічність і каталітично активність антитіл молозива породіль та їх вплив на ріст і виживання лейкемічних клітин in vitro / М. О. Старикович, Ю. Я. Кіт, Р. О. Білий, Н. Р. Скорохід, Л. Б. Гнатюк, Р. С. Стойка // ІІ з’їзд Українського товариства клітинної біології, 23 – 26 жовт. 2007 р. : тези доп. — К., 2007. — С. 208.

38. Недовіз В. Імуноглобуліни сироватки крові хворих на множинну мієлому здатні гідролізувати гістон Н1 / В. Недовіз, Ю. Кіт, Н. Р. Гут, О. Шалай, В. Логінський, Р. Стойка // ІІ з’їзд Українського товариства клітинної біології, 23 – 26 жовт. 2007 р. : тези доп.— К., 2007. — С. 277.